PD98059抑制內質網應激和改善心肺復蘇大鼠腦損傷

張宗祥 謝露 李諾 鄭君慧 楊葉桂 陳蒙華*

研究證明［1］，腦缺血再灌注時，炎癥因子、氧自由基等累積加重腦缺血再灌注損傷，而減輕ERS 并下調CHOP 的表達量可改善腦細胞凋亡。本課題組采用的是經食道交流電刺激誘導心臟驟停制備CA/CPR 后全腦缺血再灌注損傷模型，并且前期課題組已證明［2，3］，在大鼠心肺復蘇后，給予PD 可以提高其體內超氧化物歧化酶（SOD）水平，降低活性氧（ROS），減少腦細胞凋亡，提高大鼠生存率。而ERS 的減輕是否參與了PD 抑制ERK 活化的腦保護機制，目前尚不明確。本次研究目的是探究PD 抑制ERK 通路后是否會減輕ERS 并下調促凋亡因子CHOP，改善腦缺血再灌注后損傷。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與材料 （1）動物選擇 健康雄性Sprague-Dawley 大鼠（Sprague-Dawley rats，SD rats）24 只（由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供），體質量200-250 g。（2）材料 PD98059、二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）（Sigma 公司）；兔抗大鼠BIP、CHOP 抗體（CST 公司）；兔抗大鼠GADPH抗體（Abcam 公司）；抗兔二抗，HRP 標記（CST 公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（索萊寶科技有限公司）；BL-420F 生物機能實驗系統(tǒng)（四川成都泰盟儀器公司），小型動物呼吸機RWD407（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 方法 （1）心臟驟停/心肺復蘇后全腦缺血再灌注損傷模型制備使用2%的戊巴比妥鈉（3 ml/Kg）經腹腔麻醉大鼠；采用經食道交流電刺激的方法誘大鼠發(fā)生心臟驟停［4］，刺激時間為60 秒，而后行CPR 至ROSC，制備CA/PCR 后全腦缺血再灌注損傷模型，將恢復自主循環(huán)（ROSC）的大鼠隨機分為PD 組、模型組（CA 組）、DMSO 組，每組6 只，分別經靜脈給予PD（0.3 mg/kg，溶于5%DMSO）、等量生理鹽水或等量5%DMSO。另隨機選擇6 只健康大鼠為假手術組（sham 組），只行手術操作而不誘導CA/CPR。（2）神經功能評分ROSC24 小時后，對四組大鼠進行神經功能評分。（3）腦組織取材經神經功能評分后，以戊巴比妥鈉經腹腔麻醉大鼠，取大鼠腦組織，凍存于-80℃，以備后續(xù)生化實驗。（4）Western blot 檢測ERS 相關蛋白BIP、CHOP 的表達提取腦皮質組織蛋白、蛋白定量、加入loading buffer（沸煮10 分鐘）、冷卻上樣、電泳、轉膜、封閉后，分別加入兔抗BIP、CHOP 單克隆抗體，4℃搖床孵育過夜，用TBST 洗滌三次，每次10 分鐘，加入羊抗兔二抗、HRP 標記，孵育1 小時，再次洗滌三次，每次10 分鐘；加入超敏ECL 化學發(fā)光劑，應用凝膠及化學發(fā)光雙成像系統(tǒng)掃描。以GADPH 作為內參，使用Gel-Pro Analyzer 分析，測定目的條帶灰度值，以目的蛋白/內參代表蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析 所得結果用SPSS17.0 軟件分析，符合正態(tài)分布的計量資料用（±s）表示，多組實驗采用單因素方差分析，方差齊時多重比較采用LSD 法；方差不齊則采用Welch 檢驗，若差別有統(tǒng)計學意義，多重比較則用Tambane′sT2，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ROSC24 小時神經功能評分 見表1。

表1 ROSC24h 各組大鼠神經功能評分（n=6，±s）

表1 ROSC24h 各組大鼠神經功能評分（n=6，±s）

注：與Sham 組比較，*P＜0.05；與CA 組、DMSO 組比較，#P＜0.05

組別Sham 組CA 組DMSO 組PD 組神經功能評分79.50±0.84 66.17±2.04*65.33±2.16*74.67±1.63*#

2.2 Western blot 檢 測ERS 相 關 蛋 白BIP、CHOP 的表達量 見圖1、表2。

3 討 論

圖1 心肺復蘇后24 h 各組大鼠腦組織BIP、CHOP表達水平

表2 各組大鼠腦皮質組織BIP、CHOP 表達水平的比較（n=6，±s）

表2 各組大鼠腦皮質組織BIP、CHOP 表達水平的比較（n=6，±s）

注：與Sham 組比較，*P＜0.05；與CA 組、DMSO 組比較，#P＜0.05

組別Sham 組CA 組DMSO 組PD 組BIP 0.34±0.18 0.85±0.08*0.87±0.15*0.49±0.10*CHOP 0.24±0.05 0.87±0.17*0.81±0.11*0.36±0.15#

內質網穩(wěn)態(tài)失衡所致的內質網應激在腦缺血再灌注損傷中扮演著重要的角色。本實驗結果表明：在大鼠ROSC24 小時后，內質網應激相關蛋白BIP、CHOP 顯著升高，神經功能評分降低，而應用PD 抑制ERK 后，以上的內質網應激相關蛋白隨之下調，并且腦神經功能評分提高，其機制可能是PD 抑制ERK 后減輕ERS，從而改善大鼠CA/CPR后腦缺血再灌注損傷。

BIP 是ERS 的標志性蛋白。在我們的大鼠CA/CPR 后全腦缺血再灌注損傷模型中，通過western blot 檢現：ROSC 24 小時后，CA 組、DMSO 組的BIP較Sham 組明顯升高，證明本模型確實誘發(fā)了ERS。我們進一步實驗發(fā)現，CA 組、DMSO 組的CHOP 表達量較Sham 組明顯升高，神經功能評分顯示，CA 組、DMSO 組的神經功能評分明顯低于Sham 組。而CA 組與DMSO 組比較，BIP、CHOP 的表達量及神經功能評分均無統(tǒng)計學差異。由此推測，CA/CPR 后誘發(fā)ERS 并通過上調促凋亡因子CHOP 加重腦缺血再灌注損傷。

而相較于CA 組、DMSO 組，PD 組的BIP、CHOP的表達量均下降（P＜0.05）；而神經功能評分增加（P＜0.05）。這表明PD 抑制ERK 通路后，減輕了ERS 并下調CHOP 表達，提高ROSC24 小時的神經功能評分，改善腦缺血再灌注損傷。S T 等［5］研究證明減輕ERS，下調CHOP 在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著重要的作用。我們的研究結果與其類似。

目前對于ERS 與其他通路聯系的研究主要集中在c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和P38 蛋白［6］，或是P13K 基因/蛋白激酶B（Akt）［7］。本實驗通過大鼠CA/CPR 后全腦缺血再灌注損傷模型將ERS 與ERK 通路聯系起來，結果證明減輕的ERS 參與了PD 抑制ERK 通路后的腦保護機制。

另有研究證明［8］，缺血和再灌注過程中形成的ROS 可以引發(fā)ERS，減少ROS 可減輕內質網的激活，減少細胞凋亡。所以本次研究結合前期課題組的成果，我們進一步推測，可能是PD 抑制ERK 通路后有效的減少了大鼠CA/CPR 后腦內的ROS 含量，并減輕ROS 依賴性的ERS，下調促凋亡因子CHOP 的表達量，改善腦缺血再灌注損傷。但對于內質網的結構變化以及與線粒體的關系尚需進一步研究。