生物可降解Dex-APBA-IBU偶聯(lián)物的合成和表征

高亞釵

(天津工業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300387)

聚合物-藥物偶聯(lián)物(polymer-drug conjugate，PDC)是藥物遞送領(lǐng)域研究的趨勢，幾種偶聯(lián)物已成功地轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐。它的原理是將治療藥物與聚合物(例如聚乙二醇)共價(jià)綴合，而不是采用常規(guī)納米療法將治療藥物包埋在聚合物納米載體中，這種新型的納米治療方法能克服傳統(tǒng)給藥方式引發(fā)的一些缺陷，包括能改善治療藥物的溶解性，延長治療藥物體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間，降低的免疫原性，控制藥物釋放和增強(qiáng)的安全性等[1-3]。

葡聚糖為細(xì)菌性多糖之一，又稱右旋糖酐，它兼具生物相容性和良好的水溶性，且無毒，因此經(jīng)常被用作藥物納米載體。最重要的是葡聚糖主鏈上有大量的羥基，這樣的結(jié)構(gòu)不僅使得葡聚糖有良好的水溶性，而且羥基結(jié)構(gòu)有利于對葡聚糖進(jìn)行化學(xué)修飾[4]。布洛芬是一種非甾體類抗炎藥，它主要作用是抑制環(huán)氧化酶，產(chǎn)生鎮(zhèn)痛、抗炎作用，但是它的缺點(diǎn)是水溶性較差，體內(nèi)生物利用度低，這些缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了布洛芬作為抗炎藥的作用及應(yīng)用[5-6]。因此將布洛芬與葡聚糖連接成葡聚糖-布洛芬偶聯(lián)物，將兩親性偶聯(lián)物組裝成納米粒子，不僅能改善藥物的水溶性，增強(qiáng)的穩(wěn)定性，延長的血漿半衰期，還具有有效的細(xì)胞內(nèi)遞送的潛力。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器

布洛芬(IBU)，純度≥99%，阿拉丁生化科技股份有限公司；3-氨基苯硼酸(APBA)，純度≥99%，天津希恩思生化科技有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，純度≥99%，阿拉丁生化科技股份有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，純度≥99%，阿拉丁生化科技股份有限公司；葡聚糖(Dex，Mw=5000)，純度≥98%，阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜(DMSO)，分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氫氧化鈉(NaOH)，純度≥98%；天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī)，天津比郎實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LSP02-IB微流控注射泵，蘭格恒流泵有限公司；AVANCE-400MHz核磁共振譜儀(NMR)，瑞士BRUKER公司；TENSOR 37傅立葉變換紅外光譜儀，德國BRUKER公司；TU-19011紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司。

1.2 IBU-APBA單體的制備

準(zhǔn)備100 mL的圓底燒瓶，將布洛芬(2.5 mmol，0.515 g)加入10 mL無水DMSO中溶解其中。在避光條件下，然后將EDC(2.6 mmol，0.500 g)和NHS(2.6 mmol，0.300 g)溶于20 mL DMSO中，采用滴液漏斗逐滴滴加到上述布洛芬溶液中，在室溫下避光活化2 h。之后在攪拌下同樣采用滴液漏斗將APBA(5.0 mmol，0.685 g)滴加進(jìn)上述反應(yīng)物中，并在室溫下反應(yīng)4 h。反應(yīng)完的產(chǎn)物在氫氧化鈉溶液中沉淀，過濾得到乳白色的沉淀，將沉淀冷凍干燥獲得乳白色的固體粉末，收率為72%。IBU-APBA單體的制備路線如圖1。

圖1 IBU-APBA單體的制備路線圖

1.3 兩親性Dex-APBA-IBU 偶聯(lián)物的制備

準(zhǔn)備50 mL的圓底燒瓶，將IBU-APBA(0.50 mmol，0.17 g)和葡聚糖(0.05 mmol，0.25 g)加入其中，并用10 mL無水DMSO溶解完全，將混合溶液在室溫下攪拌8 h。將反應(yīng)結(jié)束后的混合物在攪拌的情況下用冰乙醇沉淀，沉淀后過濾收獲固體，將得到的固體用DMSO溶解后用冰乙醇沉淀，重復(fù)操作三次。將最終過濾的固體用DMSO溶解。將溶解后的溶液放入透析袋中(MWCO：10000 Da)用蒸餾水透析48 h，將所得溶液冷凍干燥以獲得米色固體Dex-APBA-IBU，收率為62%。Dex-APBA-IBU偶聯(lián)物的制備路線如圖2。

圖2 Dex-APBA-IBU偶聯(lián)物的制備路線圖

1.4 兩親性偶聯(lián)物的自組裝

載藥IBU/OME NPs的合成：IBU/OME NPs是采用滴加法制得的。具體實(shí)驗(yàn)操作如下：將10 mg Dex-APBA-IBU 偶聯(lián)物和5 mg 奧美拉唑完全溶解在2 mL DMSO中，然后攪拌條件下逐漸滴加到10 mL PBS緩沖溶液(pH值=7.4)。攪拌4 h后將該溶液采用蒸餾水透析(MWCO：10000Da)48 h除去DMSO，這樣最終形成的溶液為Dex-APBA-IBU納米粒子溶液。Dex-APBA-IBU偶聯(lián)物的自組裝示意圖如圖3。

圖3 Dex-APBA-IBU偶聯(lián)物的自組裝示意圖

1.5 載藥NPs載藥量的測定

1.5.1 胰島素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

奧美拉唑標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取奧美拉唑5 mg，加入到25 mL容量瓶中，用DMSO定容，配制成濃度0.2 mg/mL的奧美拉唑儲備液。再用DMSO稀釋，分別配制一系列不同濃度奧美拉唑標(biāo)準(zhǔn)溶液。用紫外分光光度計(jì)在190～400 nm掃譜，確定最佳吸光度所對應(yīng)的波長，以此波長的吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，以濃度X為橫坐標(biāo)，做圖并進(jìn)行線性擬合，得到奧美拉唑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 載藥量的測定

采用紫外分光光度計(jì)測定載藥納米粒子載藥量(DLC)，首先將包載奧美拉唑的納米粒子溶液冷凍干燥并稱量凍干樣品的質(zhì)量，將一定質(zhì)量的凍干樣品溶解在DMSO中，并在294 nm的紫外波長下檢測溶液中奧美拉唑的吸光度，最后根據(jù)奧美拉唑標(biāo)準(zhǔn)曲線確定奧美拉唑載藥納米顆粒中奧美拉唑的含量，并進(jìn)一步計(jì)算載藥納米顆粒的DLC。

公式1

2 結(jié)果與討論

2.1 IBU-APBA單體的核磁(1H-NMR)表征

圖4 IBU原料和IBU-APBA單體的1H-NMR對比圖

在EDC和NHS的條件下，通過布洛芬(IBU)的羧基與3-氨基苯硼酸(APBA)的氨基之間的酰胺反應(yīng)合成了IBU-APBA單體，如圖4所示為 IBU-APBA的1H-NMR譜圖，由譜圖中1H-NMR (DMSO，δ in ppm)：化學(xué)位移δ=10.0 ppm (1)處出現(xiàn)的特征峰對應(yīng)的是-CO-NH-的質(zhì)子峰[7]，在δ=7.5-8.0 ppm處出現(xiàn)的一組峰(2)為APBA上的苯環(huán)峰[8]，δ=0.83(g)處的吸收峰為布洛芬上的甲基峰[9]。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明成功合成了IBU-APBA單體。

2.2 Dex-APBA-IBU偶聯(lián)物的紅外(FT-IR)表征

我們通過FT-IR對Dex-APBA-IBU PDC的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。如圖5為Dex-APBA-IBU的紅外譜圖，從圖中Dextran的譜圖可以看出，3410 cm-1處的吸收峰是Dextran上的-OH的伸縮振動吸收峰，1645 cm-1處的吸收峰是Dextran上-OH的彎曲振動吸收峰[10]。從Dex-APBA-IBU的譜圖可以看出，1551 cm-1處為IBU-APBA上苯環(huán)的特征吸收峰，2956 cm-1處是IBU分子結(jié)構(gòu)中的C-H伸縮振動吸收峰，2956 cm-1處是IBU分子結(jié)構(gòu)中-CH3伸縮振動吸收峰。1330 cm-1處是形成的硼酯鍵的伸縮振動峰[11]。綜上所述，我們的數(shù)據(jù)表明Dex-APBA-IBU偶聯(lián)物被成功合成。

圖5 Dex-APBA-IBU的FT-IR譜圖

2.3 納米粒子的載藥量分析

圖 6 奧美拉唑的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線

我們采用UV-Vis法測定了奧美拉唑(OME)在294nm處的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖6是OME在DMSO中的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中吸光度(A)和OME濃度(X，μg/mL)關(guān)系的線性回歸方程如式1所示。

A=0.03739X-0.00724(R2=0.99945)(式1)

選用奧美拉唑作為模型藥物制備了載藥納米粒子Dex-APBA-IBU(IBU/OME)，載藥納米粒子對OME的載藥量通過上述所測的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，計(jì)算出納米粒子中奧美拉唑的質(zhì)量為1.48 mg，已知納米載體的質(zhì)量為10 mg，之后根據(jù)載藥量公式1求得載藥量為15%±2.0%。表明Dex-APBA-IBU納米粒子有較好的載藥性能。

3 結(jié)論

本研究合成了一種的Dex-APBA-IBU 偶聯(lián)物，并通過1H-NMR和FT-IR驗(yàn)證了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。將質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑(OME)包裹在Dex-APBA-IBU疏水內(nèi)核中形成載藥納米粒子IBU/OME，其對OME的載藥量分別為15.0%±2.0%，表明形成的偶聯(lián)物納米粒子對藥物具有較高的包載能力，為納米藥物遞送體系提供了新的思路。