HPLC法測(cè)定碳酸鈣D3顆粒中維生素D3含量的研究

萬(wàn) 慶，孫 松，許紅葉

(1 銅陵市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 銅陵 244000；2 合肥遠(yuǎn)志醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)有限公司，安徽 合肥 230088)

碳酸鈣D3顆粒為復(fù)方鈣補(bǔ)充劑，主要功效為補(bǔ)充人體的鈣含量，處方中含有維生素D3，可以促進(jìn)鈣元素在體內(nèi)的吸收。目前關(guān)于維生素D3含量測(cè)定方法主要有皂化法[1-3]、提取后氮?dú)獯蹈蓮?fù)溶法[4-6]，但均存在操作困難及準(zhǔn)確性差的問(wèn)題，本文建立的維生素D3的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)易且準(zhǔn)確性高，為碳酸鈣D3顆粒中維生素D3的含量測(cè)定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

AB135-S十萬(wàn)分之一天平，METTLER TOLEDO；島津LC-10AD液相色譜儀，蘇州島津公司；Sepax HP-Amino柱(4.6×250 mm，5 μm)；SK1200H超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；TDL-80-2B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試 藥

正己烷、異丙醇為色譜級(jí)，二甲亞砜、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚為分析級(jí)，水為屈臣氏純凈水；維生素D3對(duì)照品(批號(hào)：100061-201208，純度99.8%)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；碳酸鈣D3顆粒(生產(chǎn)批號(hào)：20180306、20180307、20180308)，北京康遠(yuǎn)制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Sepax HP-Amino(250×4.6 mm,5 μm)色譜柱；以正己烷-異丙醇(99:1)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng):265 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.5 mL·min-1；進(jìn)樣量：500 μL。在上述色譜條件下，維生素D3的理論塔板數(shù)為15012.361，對(duì)稱因子為1.102。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備

精密稱取維生素D3對(duì)照品25.23 mg，加入0.02% 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚的正己烷溶液25 mL，混勻，作為對(duì)照品貯存液1#，精密量取對(duì)照品貯存液1#1 mL加0.02% 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚的正己烷溶液20 mL，混勻，作為對(duì)照品貯存液2#。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品25袋內(nèi)容物，精密稱定，計(jì)算每袋平均裝量，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量(約相當(dāng)于維生素D3 25 μg)，置100 mL棕色量瓶中，加溶液[用二甲基亞砜-水(10:2)混合溶液制成每1 mL中含2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(Butylated hydroxytoluene; BHT)0.2 mg的溶液] 50 mL，超聲振蕩15 min，并時(shí)時(shí)振搖，保持超聲水浴溫度不超過(guò)30 ℃，精密加0.02% 2，6-二叔丁基對(duì)甲酚的正己烷溶液25 mL，振搖15 min后，離心5 min(4000 rpm)，分取上層溶液，避光靜置1 h后得澄清溶液，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取碳酸鈣D3顆粒，按“2.2.2”項(xiàng)方法制得系統(tǒng)適用性溶液，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖(見(jiàn)圖1)。

圖1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)色譜圖

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn)

按碳酸鈣D3顆粒處方制備不含維生素D3的陰性空白樣品，按“2.2.2”項(xiàng)方法制得陰性對(duì)照溶液，用于方法的基質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn)。分別對(duì)維生素D3對(duì)照品、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣分析，考察樣品處方中輔料對(duì)維生素D3色譜峰是否有干擾。結(jié)果：樣品中輔料對(duì)維生素D3色譜峰無(wú)干擾。為進(jìn)一步考察方法的專屬性，將碳酸鈣D3顆粒樣品分別進(jìn)行高溫、光照、酸化、堿化和氧化條件下進(jìn)行了強(qiáng)制性的降解實(shí)驗(yàn)，以排除各條件下的降解產(chǎn)物對(duì)維生素D3色譜峰的干擾。精密稱取碳酸鈣D3顆粒10 g，按“2.2.2”項(xiàng)方法制得供試品溶液，取上述供試品溶液3 mL于80 ℃水浴中加熱6 h，冷卻值室溫，作為供試品溶液。取上述供試品溶液3 mL，加入100 μL 30% H2O2溶液，放置6 h后，作為供試品溶液。取上述供試品溶液3 mL加入50 μL三氟乙酸，放置5 min后，加入50 μL二乙胺中和至中性，作為供試品溶液。取上述供試品溶液3 mL加入100 μL二乙胺，放置8 h后，加入100 μL三氟乙酸中和至中性，作為供試品溶液。將各條件下供試品溶液注入高效液相色譜儀中。結(jié)果維生素D3在酸化時(shí)峰面積下降，說(shuō)明有降解發(fā)生，不穩(wěn)定，其余條件峰面積基本無(wú)變化(見(jiàn)圖2)。

圖2 專屬性實(shí)驗(yàn)(A-H)

2.5 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品貯存液2# 2 mL，加入0.02% 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚的正己烷溶液50 mL，即得對(duì)照品貯存液3#。分別精密量取對(duì)照品貯存液3# 2、4、5、6、8 mL，分別置10 mL量瓶中定容，搖勻，作為各對(duì)照品溶液。取各濃度的對(duì)照品溶液，依次由低濃度至高濃度注樣，各濃度平行注樣2針，取峰面積平均值。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得野黃芩苷線性回歸方程：A=1137838.405×C-19848.177(R=0.9995，n=5)。結(jié)果表明：維生素D3在0.40～1.60 μg/mL的濃度范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度考察

取維生素D3對(duì)照品貯存液1#，精密吸取500 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定各自峰面積積分值，計(jì)算維生素D3峰面積的RSD為0.88%，充分說(shuō)明本儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品溶液，在配置后于室溫放置0、2、4、6、8 h，分別精密進(jìn)樣500 μL，最終維生素D3的峰面積積分值保持穩(wěn)定，RSD為1.00%，結(jié)果表明：供試品溶液中維生素D3在室溫放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批次的碳酸鈣D3顆粒樣品，按照“2.2.2”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，分別精密進(jìn)樣500 μL，記錄每份供試品溶液維生素D3成分的峰面積并進(jìn)行含量計(jì)算。結(jié)果維生素D3的含量RSD值為0.50%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率實(shí)驗(yàn)

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表1所示，精密稱取維生素D3對(duì)照10.43 mg、12.54 mg、15.03 mg，加入0.02% 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚的正己烷溶液10 mL，混勻，作為對(duì)照品貯存液，精密量取對(duì)照品貯存液1 mL 加0.02% 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚的正己烷溶液50 mL，混勻，分別制得濃度為20.82 μg/mL、25.01 μg/mL、30.00 μg/mL的對(duì)照品貯存液。精密稱取陰性樣品10 g，分別加入不同濃度的對(duì)照品貯存液1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備相當(dāng)于80%、100%、120%濃度的樣品溶液，每個(gè)濃度平行制備3份樣品，分別精密進(jìn)樣500 μL，記錄每份供試品溶液維生素D3成分的峰面積并進(jìn)行回收率計(jì)算，測(cè)得平均回收率為99.0%，RSD=1.50%。

2.10 樣品的含量測(cè)定

分別測(cè)得三批碳酸鈣D3顆粒樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下分別精密進(jìn)樣500 μL，記錄每份供試品溶液維生素D3成分的峰面積并進(jìn)行含量計(jì)算。三批樣品結(jié)果分別為99.10%、102.31%、98.77%。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)維生素D3紫外波長(zhǎng)掃描，結(jié)果維生素D3在265nm處有最大吸收，因而選擇265nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。通過(guò)耐用性考察，分別對(duì)波長(zhǎng)、柱溫、流速進(jìn)行考察，最終得到最佳的色譜條件，確保制劑中維生素D3的色譜峰分離度、理論塔板數(shù)及保留時(shí)間均達(dá)到要求。通過(guò)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證中強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)得知。樣品中的維生素D3在加酸條件下有所降解，產(chǎn)生的降解物在已建立的色譜條件下均未見(jiàn)明顯的色譜峰，不干擾樣品中的維生素D3的測(cè)定。

本文建立了在碳酸鈣D3顆粒中維生素D3的含量測(cè)定方法，檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低，檢測(cè)結(jié)果的重現(xiàn)性良好，專屬性強(qiáng)，對(duì)含有維生素D3的制劑提供一種新的檢測(cè)方法。