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    加味竹葉石膏湯對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠Toll樣受體抗炎作用的機(jī)制研究*

    2020-05-30 13:03:04
    浙江中醫(yī)雜志 2020年5期
    關(guān)鍵詞:竹葉陽性細(xì)胞石膏

    舟山醫(yī)院 浙江 舟山 316021

    痛風(fēng)是由單鈉尿酸鹽晶體誘發(fā)的炎癥性疾病[1]。加味竹葉石膏湯臨床上治療濕熱內(nèi)蘊(yùn)型痛風(fēng),并取得了顯著的效果。本研究旨在通過觀察加味竹葉石膏湯在大鼠痛風(fēng)模型中的應(yīng)用效果,及對Toll樣受體(TLR)、炎癥相關(guān)因子水平的變化,從而探討其抗炎作用機(jī)制。報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選取清潔級SD大鼠90只(江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2018-0008;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號:SYXK(蘇)2018-0027),雄性,體質(zhì)量180±20g,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為空白組、模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組,每組18只。所有大鼠統(tǒng)一飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室中,溫度20±2℃,濕度60%~70%,光暗周期(12h/12h)每4只大鼠一籠自由活動(dòng)。

    1.2 研究方法:分述如下。

    1.2.1 動(dòng)物造模:模型誘導(dǎo)方法:分組后,除空白組,其余4組小鼠經(jīng)2.5%異氟烷麻醉后,以碘酒、乙醇消毒局部,用1ml滅菌注射針在小鼠右側(cè)距小腿(踝關(guān)節(jié)背側(cè),從45°方向插入至脛骨肌腱內(nèi)側(cè),將含0.5mg尿酸鈉溶液20μl注入到關(guān)節(jié)腔,正常對照組注射20μl磷酸緩沖鹽溶液(PBS),4天后處理小鼠,進(jìn)行指標(biāo)檢測。

    1.2.2 中藥配置和給藥劑量:加味竹葉石膏湯組成:淡竹葉、麥門冬各12g,生石膏、薏苡仁各30g,知母、半夏各10g,北沙參、土茯苓各15g,甘草6g。除生石膏外其余藥物冷水浸泡30分鐘,武火煎煮至沸騰狀態(tài)后改文火煎煮30分鐘,濾出藥汁后加水復(fù)煎30分鐘,將2次藥汁混合共800ml。成人藥量低劑量為150ml/次,中劑量為200ml/次,高劑量為250ml/次,根據(jù)70kg人與200g大鼠藥物劑量換算標(biāo)準(zhǔn),低劑量組為2.68ml/次,中劑量組為3.57ml/次,高劑量組為4.46ml/次,每日早、中、晚各1次。模型組同期給予約3.5ml0.9%氯化鈉溶液,空白組不給予任何藥物。

    1.2.3 觀察指標(biāo):所有大鼠在造模96h后(禁食不禁水12h)腹腔注射10%水合氯醛3.5ml/kg進(jìn)行麻醉,取腹主動(dòng)脈血3ml靜置1h后,離心取上清液,置于-20℃冰箱中保存待檢。血液收集完成后,脫頸處死,取受試關(guān)節(jié)于4%多聚甲醛中固定,7d后進(jìn)行脫鈣處理。血液檢測指標(biāo)包括血清尿酸(BUA)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6),均采用ELISA檢測,受試關(guān)節(jié)脫鈣處理后取組織切片、HE染色后采用免疫組化法檢測踝關(guān)節(jié)滑膜組織TLR2、TLR4蛋白表達(dá)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有檢測結(jié)果均為計(jì)量資料,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠血液檢測結(jié)果比較:與空白組相比,其他各組BUA、IL-1β、IL-6水平均增高(P<0.05);與模型對照組相比,治療后低、中、高劑量治療組BUA、IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05);與低、中劑量組相比,高劑量治療組IL-1β、IL-6水平降低(P<0.05);低、中劑量組治療后IL-1β、IL-6水平無明顯差異(P>0.05);低、中、高劑量治療組治療后BUA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

    表1 各組大鼠血液檢測結(jié)果比較(±s)

    注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與低、中劑量組比較,▲P<0.05。

    IL-6(pg/ml)34.82±10.05 69.30±6.42*65.31±5.48*△64.02±4.27*△55.32± 7.18*△▲組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組BUA(μmol/L)193.21±22.45 280.14±30.95*234.14±19.02*△220.29±11.16*△223.05±11.10*△IL-1β(pg/ml)3.01±1.54 5.23±1.30*4.97±1.29*△4.92±1.52*△4.46±1.23*△▲

    2.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)比較:與空白組相比,其他各組TLR2、TLR4陽性細(xì)胞比例、蛋白表達(dá)水平均增高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,治療后低、中、高劑量治療組TLR2、TLR4陽性細(xì)胞比例、蛋白表達(dá)水平降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與低、中劑量組相比,高劑量組TLR2、TLR4陽性細(xì)胞比例、蛋白表達(dá)水平降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低、中劑量組治療后TLR2、TLR4陽性細(xì)胞比例、蛋白表達(dá)水平水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

    表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)比較(±s)

    表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)比較(±s)

    注:與空白組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05;與低、中劑量組比較,▲P<0.05。

    組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組TLR2 TLR4例數(shù)18 18 18 18 18 TLR4蛋白表達(dá)1.02±0.37 3.67±0.61*3.02±0.25*△2.79±0.30*△2.58±0.21*△▲陽性細(xì)胞(%)11.02±2.48 35.68±7.62*30.01±2.73*△28.42±2.76*△27.35±2.08*△▲染色強(qiáng)度0-1 2-3 1-2 1-2 1-2 TLR2蛋白表達(dá)1.21±0.28 3.53±0.78*2.99±0.31*△2.91±0.29*△2.72±0.19*△▲陽性細(xì)胞(%)10.29±4.59 36.34±5.79*30.38±2.49*△28.73±3.35*△26.52±1.93*△▲染色強(qiáng)度0-1 2-3 1-2 1-2 1-2

    3 討論

    痛風(fēng)中醫(yī)學(xué)中可歸屬于“熱痹”范疇,主要與素體稟賦不足,或調(diào)攝不慎,長期嗜欲膏粱厚味,日久導(dǎo)致脾胃運(yùn)化失常,濕熱內(nèi)蘊(yùn)有關(guān)。本病有別于一般“痹病”之風(fēng)寒濕邪入侵,故治宜清熱化濕的同時(shí),兼顧健脾養(yǎng)陰?!秱摗分袢~石膏湯方中石膏、竹葉清熱除煩,人參、麥冬益氣養(yǎng)陰,半夏降逆,粳米和中。由于痛風(fēng)發(fā)病和濕熱內(nèi)聚、脾失健運(yùn)密切相關(guān),故將原方人參易為北沙參,去粳米加用薏苡仁、土茯苓,重在清熱瀉火、養(yǎng)陰除煩同時(shí)兼顧健脾和中、滲濕化濁。古方新用,具有清補(bǔ)兩顧、清熱兼健脾、補(bǔ)虛不戀邪的特點(diǎn),適用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎濕熱蘊(yùn)結(jié)型。

    研究表明,在諸多炎癥因子中,IL-1β已成為痛風(fēng)發(fā)病過程中的關(guān)鍵因子,對于痛風(fēng)炎癥網(wǎng)絡(luò)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用[1]。痛風(fēng)急性發(fā)作時(shí)關(guān)節(jié)腔內(nèi)已形成微晶體沉淀,而該沉淀物的來源為尿酸鈉[2-3],Toll樣受體作為組織細(xì)胞表面的感應(yīng)器,對尿酸鈉微晶體具有較高的敏感性,可迅速激活免疫應(yīng)答,通過一系列細(xì)胞結(jié)合、細(xì)胞活化、細(xì)胞激活等作用,最終啟動(dòng)IL-1β的表達(dá),使炎癥反應(yīng)逐漸加劇,并出現(xiàn)炎癥臨床表現(xiàn)。因此從理論上分析,Toll受體相關(guān)因子水平可提示尿酸鈉微晶體的沉積量是否足以引發(fā)痛風(fēng)癥狀,其中TLR2、TLR4是Toll受體的代表因子,目前已有研究證實(shí)TLR2、TLR4與痛風(fēng)癥狀的發(fā)生及緩解有直接的關(guān)系[4]。

    我們既往的研究顯示,加味竹葉石膏湯能夠通過NLRP3炎癥信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控作用,抑制TNF-α、Caspase-1等炎癥因子的水平,顯著改善關(guān)節(jié)腫脹程度和炎癥指數(shù)[5-6]。為進(jìn)一步探討加味竹葉石膏湯在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的抗炎作用機(jī)制,本次研究對痛風(fēng)模型大鼠Toll受體相關(guān)因子及炎性因子進(jìn)行觀察,結(jié)果顯示痛風(fēng)急性發(fā)作后在血尿酸、IL-1β和IL-6水平升高的同時(shí),以TLR2、TLR4為代表的Toll受體陽性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)也隨之升高,這與Toll受體對尿酸升高后尿酸鈉沉積微晶體的敏感性有關(guān)。通過加味竹葉石膏湯治療后,大鼠BUA、IL-1β和IL-6水平降低,并且TLR2、TLR4的陽性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)也明顯降低,由此提示加味竹葉石膏湯對于改善急性痛風(fēng)大鼠BUA水平及炎性反應(yīng)有顯著的效果,其作用機(jī)理與Toll免疫應(yīng)答機(jī)制有關(guān),以目前的研究結(jié)果推測,加味竹葉石膏湯可抑制關(guān)節(jié)滑膜腔中TLR2、TLR4蛋白的表達(dá),減少尿酸鈉微晶體的堆積,從而起到緩解炎癥反應(yīng)的效果。而通過對不同劑量加味竹葉石膏湯的作用效果比較,較高劑量藥物作用在短期內(nèi)效果更佳。

    由此,筆者認(rèn)為在痛風(fēng)急性期應(yīng)用加味竹葉石膏湯具有可行性和有效性,而且作用機(jī)制與Toll受體的免疫應(yīng)答有密切的關(guān)系。

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