特應(yīng)性皮炎患者外周血T細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果分析

趙曉嵐 劉玉梅 田歆

（廣州市皮膚病防治所皮膚科 廣東 廣州 510030）

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，初發(fā)于嬰兒期及兒童期早期，呈慢性經(jīng)過，患兒伴發(fā)過敏性鼻炎或哮喘。研究發(fā)現(xiàn)，AD的患病率呈逐年上升的趨勢(shì)，大部分患者病情可遷延至成年，嚴(yán)重影響了患者及其家庭成員的生活質(zhì)量[1]。目前AD的病因及發(fā)病機(jī)制比較明確，一般認(rèn)為是在一定遺傳背景和(或)環(huán)境因素作用下，造成機(jī)體皮膚屏障功能障礙或直接引起機(jī)體的免疫反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致變應(yīng)性或非變應(yīng)性炎癥反應(yīng)。其中各種T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子在AD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用[2-3]，本文分析AD患者外周血T細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果及意義。

1.資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1診斷標(biāo)準(zhǔn) Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)的AD確診標(biāo)準(zhǔn)所需具備的必要條件為有皮膚瘙癢史，并有下列5條其中三條或者三條以上：①既往有過敏性鼻炎史或哮喘史（或一級(jí)親屬存在4歲以下兒童發(fā)生AD史）；②屈側(cè)皮膚受累史，包括踝前、腘窩、肘窩或圍繞頸周（低于10歲的兒童還包括頰部）；③全身皮膚干燥史；④發(fā)病時(shí)間為2歲前（適用于4歲以上者）；⑤屈側(cè)有濕疹（或4歲以下兒童頰部、前額和遠(yuǎn)端肢體濕疹）[4]。

1.1.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 2歲≤年齡≤60 歲，性別不限，符合Williams的診斷標(biāo)準(zhǔn)。無嚴(yán)重內(nèi)科疾病及精神科疾病，排除妊娠及哺乳期婦女，近1周內(nèi)停服抗組胺藥、近1月內(nèi)未接受系統(tǒng)性糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑治療。

1.1.3病例資料 選取本院2018年1—12月期間收治的40例AD患者作為研究組，所有AD患者符合Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)；對(duì)照組為不患有AD及無家族過敏史的健康志愿者40例，研究組年齡4～60歲，平均年齡(16.40±6.41)歲，其中男性22例，女性18例；對(duì)照組年齡3～55歲，平均年齡(20.20±3.28)歲，其中男性21例，女性19例；兩組受試者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 方法

分別取兩組患者空腹?fàn)顟B(tài)下的外周靜脈血共計(jì)6ml，分別置于兩支試管中：

第一只試管首先用肝素進(jìn)行抗凝操作，再借助流式細(xì)胞儀（型號(hào)：賽默飛Attune NxT，廠家：廣州吉源生物科技有限公司）的幫助進(jìn)行有關(guān)CD4+、CD8+的檢測(cè)工作。將一支流式管設(shè)置為樣品測(cè)試管，將約為100μl的抗凝全血置于該試管中，依次加入CD4-RD1/CD8-ECD抗體，抗體量為10μl，在室溫的溫度條件下，確保避光保護(hù)確切的情況下將上述混合液渦旋混勻，孵育約15分鐘取出試管，將500μl的紅細(xì)胞裂解液緩緩加到試管中，而后仍要在室溫的溫度條件下，確保避光保護(hù)確切的情況下將上述混合液渦旋混勻約10分鐘，再以1200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，時(shí)間控制在5分鐘，離心完成后棄去上清液，將2ml的PBS緩緩加入到試管中，重復(fù)渦旋混勻，保持上述以1200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速不變，再次離心，時(shí)間仍控制在5分鐘，離心完成后棄去上清液，將500μl的PBS輕柔的加入到試管中，確?；靹?，在溫度為4℃，避光保護(hù)的條件下，完成上機(jī)檢驗(yàn)[5]。

第二只試管借助ELISA法相關(guān)原理完成對(duì)外周靜脈血中的IL-4、IL-10、IL-12的檢測(cè)。首先以1200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速對(duì)待檢標(biāo)本進(jìn)行離心，時(shí)間控制在5分鐘，之后小心的將上層血清緩緩注入到EP管內(nèi)；再分別設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔以準(zhǔn)備完成加樣操作。首先將100μl樣品稀釋液緩緩加入到空白孔內(nèi)，將同樣量的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品加入到剩余兩個(gè)孔內(nèi)，再將樣品加入到酶標(biāo)板孔底部，在37℃的溫度條件下反應(yīng)2小時(shí)，將孔內(nèi)的液體一一棄去并甩干，無需進(jìn)行洗滌，之后將100μl生物素標(biāo)記抗體工作液加入到每個(gè)孔內(nèi)，洗板3次，每次將其完全浸泡2分鐘左右，200μl/孔甩干。取100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液緩緩加入到每個(gè)孔內(nèi)，在37℃的溫度條件下孵育1小時(shí)，再次將孔內(nèi)的液體一一棄去并甩干，并洗板5次，每次將其完全浸泡2分鐘左右，200μl/孔甩干。按照順序?qū)?0μl的底物溶液依次加入到每個(gè)孔內(nèi)，在37℃的溫度條件下避光顯色，為終止反應(yīng)，需按照順序?qū)?0μl的底物溶液依次加入到每個(gè)孔內(nèi)，再按照順序借助酶聯(lián)儀的輔助在450nm的波長(zhǎng)設(shè)定條件下測(cè)量各孔的光密度[6-7]。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1外周血不同T細(xì)胞亞群占比比較，具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)包括CD4+、CD8+、CD4+/CD8+。

1.3.2外周血不同細(xì)胞因子表達(dá)情況比較，具體評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)包括IL-4、IL-10、IL-12。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 觀察對(duì)比兩組受試者外周血不同T細(xì)胞亞群占比情況

研究組患者的CD4+、CD4+/CD8+顯著高于對(duì)照組，但CD8+水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組受試者外周血不同T細(xì)胞亞群占比情況（±s）

表1 兩組受試者外周血不同T細(xì)胞亞群占比情況（±s）

組別nCD4+CD8+CD4+/CD8+研究組4049.43±9.2314.78±3.822.82±0.74對(duì)照組4031.87±4.8929.92±4.021.42±0.51 t 20.98318.24412.983 P 0.0000.0060.015

2.2 觀察對(duì)比兩組受試者外周血不同細(xì)胞因子表達(dá)情況

研究組患者的IL-4、IL-10的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，而IL-12的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組受試者外周血不同細(xì)胞因子表達(dá)情況比較（±s，pg/ml）

表2 兩組受試者外周血不同細(xì)胞因子表達(dá)情況比較（±s，pg/ml）

組別nIL-4IL-10IL-12研究組404.04±0.746.32±1.161.01±0.64對(duì)照組400.89±0.211.45±1.216.89±1.03 t 18.87216.03415.982 P 0.0180.0240.027

3.討論

特應(yīng)性皮炎（AD）是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，初發(fā)于嬰兒期及兒童期早期，呈慢性經(jīng)過，患兒伴發(fā)過敏性鼻炎或哮喘[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，AD的患病率呈逐年上升的趨勢(shì)，大部分患者病情可遷延至成年，嚴(yán)重影響了患者及其家庭成員的生活質(zhì)量。目前認(rèn)為AD的發(fā)生可能與患者免疫機(jī)制異常存在密切的關(guān)聯(lián)性，T淋巴細(xì)胞在人體免疫細(xì)胞中占有重要的地位，它包括CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞，這兩種淋巴細(xì)胞分泌出多種的細(xì)胞因子參與機(jī)體免疫反應(yīng)[10]。將CD4+T淋巴細(xì)胞群分為輔助性T細(xì)胞（T helper cells，Th）和免疫抑制性調(diào)節(jié)T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）[11]。通常Th細(xì)胞通過啟動(dòng)或維持免疫應(yīng)答在AD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用，而Treg細(xì)胞通過減弱免疫應(yīng)答負(fù)責(zé)維持免疫穩(wěn)態(tài)和外周不耐受。AD皮損浸潤(rùn)的CD4+T淋巴細(xì)胞主要是Th細(xì)胞，它參與了細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)從而影響了AD的發(fā)生發(fā)展[12-13]。CD8+T淋巴細(xì)胞分為抑制性T細(xì)胞（suppressor T cell，Ts）及殺傷T細(xì)胞（killer T cell，Tc）。Ts細(xì)胞抑制Th細(xì)胞活性，Tc細(xì)胞具有殺傷靶細(xì)胞活性的作用，從而間接抑制B細(xì)胞的分化，對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫起負(fù)向調(diào)節(jié)的作用[14]。在細(xì)胞因子方面，CD4+T淋巴細(xì)胞可分泌IL-4，IL-10。初始CD4+T淋巴細(xì)胞可以直接轉(zhuǎn)化為Th9細(xì)胞。Th9細(xì)胞具有促炎作用。IL-4和IL-10協(xié)同作用下誘導(dǎo)Th9產(chǎn)生增多，從而加重了炎癥期間的組織損傷。CD8+T淋巴細(xì)胞可分泌IL-12，IL-12可協(xié)同刺激Th細(xì)胞去產(chǎn)生IFN-γ，從而抑制Th細(xì)胞和IgE合成[15]。正常情況下，兩種淋巴細(xì)胞比例恰當(dāng)，相互協(xié)助，共同參與并維持體液免疫與細(xì)胞免疫的平衡，這些細(xì)胞因子通過細(xì)胞間接觸抑制作用促進(jìn)了AD的發(fā)生發(fā)展。而本文證實(shí)研究組患者的CD4+、CD4+/CD8+顯著高于對(duì)照組，但CD8+水平顯著低于對(duì)照組，這說明AD患者存在著免疫紊亂，患者機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞免疫與體液免疫失衡，細(xì)胞與體液免疫免疫相比，前者在AD患者體內(nèi)占有優(yōu)勢(shì)，兩種淋巴細(xì)胞比例失衡導(dǎo)致其分泌的細(xì)胞因子失衡，研究組患者的IL-4、IL-10的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，而IL-12的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。綜合兩組受試者外周血不同T細(xì)胞亞群的占比情況與外周血不同細(xì)胞因子的表達(dá)情況，我們發(fā)現(xiàn)AD患者存在著一定的免疫異常。

綜上所述，特應(yīng)性皮炎患者存在著較為嚴(yán)重的免疫紊亂，患者機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞免疫與體液免疫失衡。