熒光光譜法研究苯乙醇胺A與CdTe納米材料的相互作用

熊 艷，徐 俊，邱素艷, 魏益華，張金艷*

1. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與標(biāo)準(zhǔn)研究所，江西 南昌 330200 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(南昌)，江西 南昌 330200

引 言

苯乙醇胺A屬于β-受體激動劑，又稱為克倫巴胺，克侖巴胺，學(xué)名為2-4-(4-硝基苯基)丁基-2-羥基氨基-1-甲氧基苯乙醇，是一種人工合成的化學(xué)物質(zhì)。2010年9月四川省廣安市廣安區(qū)棗山鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站對某養(yǎng)豬場例行違禁藥物監(jiān)測中，用萊克多巴胺測試卡分別檢測母豬、仔豬和育肥豬尿液，發(fā)現(xiàn)該場育肥豬尿檢呈陽性，之后確認(rèn)是新型添加物苯乙醇胺A。同時(shí)也在破獲的瘦肉精事件中，發(fā)現(xiàn)飼料中檢測出以前從未出現(xiàn)過的苯乙醇胺A。苯乙醇胺與其他瘦肉精品種如萊克多巴胺等相比，同樣可使動物體內(nèi)的營養(yǎng)成分由脂肪向肌肉轉(zhuǎn)移，顯著提高胴體瘦肉率和飼料報(bào)酬[1-3]。但是，β-受體激動劑易在動物組織，特別是內(nèi)臟中蓄積殘留，其通過食物鏈進(jìn)入人體后可引發(fā)肌肉震顫、心律失常、頭痛等癥狀，嚴(yán)重者可能危及生命[4-5]。鑒于以上原因，中華人民共和國1519號公告規(guī)定，禁止在飼料和動物飲水中使用苯乙醇胺A等物質(zhì)[6]。歐盟已于1996年禁止在畜牧生產(chǎn)中使用該類藥(ECDirective 96/22/EC)。但是，目前仍有養(yǎng)殖者將其違法使用在畜牧業(yè)中，引發(fā)藥物殘留，從而對消費(fèi)者健康造成嚴(yán)重?fù)p害。

目前的檢測分析方法有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[7]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、ELISA法[9]、免疫法[10]等。以上分析方法都分別存在樣品前處理過程復(fù)雜、需要進(jìn)行衍生化，分析時(shí)間過長，涉及使用大型精密儀器設(shè)備等缺點(diǎn)，無法滿足現(xiàn)場檢驗(yàn)檢測需求。而膠體金試紙法存在靈敏度過低等缺陷。因此迫于開發(fā)一種無需復(fù)雜的前處理過程，無需昂貴精密的儀器設(shè)備，在普通的實(shí)驗(yàn)室就能夠開展的分析方法，鑒于該類藥物的監(jiān)測最常采集的活體樣本是尿液，基層監(jiān)督檢測中也多以尿液為樣本進(jìn)行速測篩選。因此，建立健全對此類藥物快速并行之有效的檢測方法是十分重要和必要的，這將對基層執(zhí)法監(jiān)測提供快速、準(zhǔn)確、有效的技術(shù)支撐，來滿足農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全日常監(jiān)督監(jiān)管的需要。

量子點(diǎn)作為現(xiàn)代科技的研究前沿，具有熒光產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性強(qiáng)、熒光壽命長、生物相容性好、激發(fā)波長范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，與生物學(xué)、免疫學(xué)等結(jié)合運(yùn)用到現(xiàn)有檢測方法中成為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究領(lǐng)域的發(fā)展趨勢[11-13]。在目前已報(bào)道的應(yīng)用研究中，量子點(diǎn)已成功的應(yīng)用部分β-受體激動劑的檢測分析中，如沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺，但應(yīng)用到苯乙醇胺A的檢測還并不多見?；诖?，本文以簡化樣品前處理過程，在一定濃度的CdTe溶液里，苯乙醇胺A能夠使體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，并呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，因此建立一種檢測豬尿中的苯乙醇胺A的熒光增敏方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 設(shè)備與試劑

F-7000型熒光分光光度計(jì)(日立公司)； U3900型紫外可見分光光度計(jì)(日立公司)； pHS-3C酸度計(jì)(上海雷磁公司)； 波消解儀(美國CEM公司)。

碲粉(Te99.999%，中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)； 氯化鎘(CdCl2·2.5H2O，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)； 硼氫化鈉(96%，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)； 氫氧化鈉(分析純，中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑公司)； 羅丹明6G(分析純，上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司)，克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、苯乙醇胺A、特布他林、氯丙那林、妥布特羅、噴布特羅、西馬特羅、非諾特羅標(biāo)準(zhǔn)品，巰基丙酸等均購自Sigma-Aldrich公司； 實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q水處理系統(tǒng)(Millipore)制的。

1.2 方法

1.2.1 CdTe納米材料的制備

具體制備過程參見文獻(xiàn)[14]，在此基礎(chǔ)上，略作改動，以巰基丙酸作為穩(wěn)定劑。稱取0.07 g CdCl2·2.5H2O溶于190 mL高純水中，再加入80 μL巰基丙酸，形成懸濁液體系； 用0.1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)所述懸濁液體系的pH為11，通高純氮?dú)?0 min，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加入200 μL NaHTe溶液(通過Te粉與硼氫化鈉反應(yīng)所得)，控制溶液中Cd2+，HTe-，巰基丙酸的摩爾比為1.0∶1.0∶3.0，得CdTe納米材料前驅(qū)體； 將所述CdTe納米材料前驅(qū)體轉(zhuǎn)移至微波消解儀中，功率設(shè)定800 W，100 ℃加熱10 min，經(jīng)冷卻、洗滌、離心，即得所述CdTe納米材料。

1.2.2 制作熒光增敏標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制一系列不同濃度的苯乙醇胺A標(biāo)準(zhǔn)溶液，并將其分別移至5 mL的比色管中，向每個(gè)所述比色管中均加入1.0 mL濃度為7.25×10-4mol·L-1的CdTe溶液，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液定容，搖勻后，室溫放置15 min，用分子熒光光度計(jì)檢測上述各個(gè)體系的熒光強(qiáng)度F； 同時(shí)，取1.0 mL濃度為7.25×10-4mol·L-1的CdTe溶液加入到5mL的比色管中，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液定容，搖勻后室溫放置15 min，用分子熒光光度計(jì)檢測體系的熒光強(qiáng)度F0； 以苯乙醇胺A濃度為橫坐標(biāo)，以F/F0為縱坐標(biāo)，得苯乙醇胺A對CdTe納米材料熒光增敏的線性回歸方程。

1.2.3 樣品的測試

分別取1.0 mL 7.25×10-4mol·L-1的CdTe溶液和含苯乙醇胺A的樣品液加入到5 mL的比色管中，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液定容，搖勻使其充分反應(yīng)，室溫放置15 min，用分子熒光光度計(jì)檢測得到體系的熒光強(qiáng)度，與所述苯乙醇胺A對CdTe納米材料熒光增敏的線性回歸方程對照，即得所述樣品液中苯乙醇胺A的含量。

1.2.4 豬尿樣品的前處理

取豬尿樣品液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.0，過濾并將收集濾液，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdTe納米材料的TEM和熒光光譜圖

圖1和圖2是微波合成的CdTe納米材料的TEM圖譜和熒光光譜圖。從圖中可以看出，微波輻射法合成的CdTe納米材料大小粒徑比較均勻，粒徑約為4.5 nm，參照Demas[15]的方法來測試該量子點(diǎn)的量子產(chǎn)率達(dá)52.341%。該CdTe納米材料的最大發(fā)射波長為650 nm，半峰寬為45 nm。

圖1 CdTe納米材料的TEM圖Fig.1 The TEM of CdTe nanomaterials

圖2 CdTe納米材料的熒光光譜圖Fig.2 The fluorescence spectrum of CdTe nanomaterials

2.2 CdTe納米材料與苯乙醇胺A的相互作用圖譜

圖3為不同濃度的苯乙醇胺A與CdTe納米材料的相互作用熒光圖譜。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，在CdTe納米材料體系里，當(dāng)加入8，16，32，40，60，80和120 μg·L-1不同濃度的苯乙醇胺A溶液，體系的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)了有規(guī)律的增強(qiáng)，而且體系的最大的熒光波長沒有變動。以苯乙醇胺A濃度為橫坐標(biāo)，以F/F0為縱坐標(biāo)，得苯乙醇胺A對CdTe納米材料熒光增敏的線性回歸方程見圖4，其熒光增敏標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程F/F0=0.001 9c+ 1.032 1，線性相關(guān)系數(shù)為0.996。不同濃度的苯乙醇胺A能夠使CdTe體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的可能原因是由于苯乙醇胺A能夠有效的填補(bǔ)CdTe納米材料的表面缺陷，進(jìn)而增強(qiáng)了體系的熒光強(qiáng)度。

圖3 CdTe納米材料與不同濃度苯乙醇胺A的光譜變化圖

1—8體系中苯乙醇胺A的濃度分別為0，8，16，32，40，60，80和120 μg·L-1

Fig.3 The spectrum between CdTe nanomaterials and phenylethanolamine A

The concentration of phenylethanolamine A was 0，8，16，32，40，60，80 and 120 μg·L-1respectively

圖4 苯乙醇胺A對CdTe納米材料的熒光增敏標(biāo)準(zhǔn)曲線

Fig.4 Standard curve for fluorescence enhancement of CdTe nanomaterials by Phenylethanolamine A

2.3 影響因子

在體系優(yōu)化的過程中，固定體系內(nèi)的苯乙醇胺A的濃度為100 μg·L-1。

2.3.1 緩沖溶液的影響

實(shí)驗(yàn)考察了KH2PO4-NaOH，Tris-HCl，KH2PO4-Na2HPO4，Na2HPO4-檸檬酸4種緩沖溶液(相同的pH值，相同的濃度)對體系的ΔF的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)了在KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中，體系的熒光強(qiáng)度相對穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)將其作為緩沖溶液，當(dāng)該緩沖溶液的濃度為0.06 mol·L-1時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度最大。

2.3.2 緩沖溶液pH的影響

在pH值7.2～9.8之間考察了KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液對體系ΔF的影響。結(jié)果表明當(dāng)pH值為7.4時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度ΔF最大。故本實(shí)驗(yàn)選擇pH為7.4的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液。

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、試劑加入順序的影響

實(shí)驗(yàn)選擇不同濃度的苯乙醇胺A溶液與固定濃度的CdTe溶液先混合，用磷酸鹽緩沖溶液定容，最佳的反應(yīng)時(shí)間是15 min，最佳的反應(yīng)溫度為20 ℃。

2.3.4 線性范圍、精密度、檢出限

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體系的熒光強(qiáng)度與苯乙醇胺A在8～120 μg·L-1, 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。其回歸方程為F/F0=0.001 9c+1.032 1，線性相關(guān)系數(shù)為0.996，方法檢出限為3.5 μg·L-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%(n=6)。

2.3.5 共存物質(zhì)的影響

2.4 機(jī)理探討

以巰基丙酸作為穩(wěn)定劑合成CdTe納米材料，表面具有很多缺陷。在一定的條件下，引入不同濃度苯乙醇胺A，耦合作用鏈接到表面具有羧基的CdTe量子點(diǎn)表面上，能夠有效地彌補(bǔ)CdTe納米材料的表面缺陷，從而使得體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。因此能夠基于此原理，建立一種檢測分析豬尿中的苯乙醇胺A的熒光增敏方法。

2.5 樣本的測定

利用CdTe納米材料熒光增敏法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法連用對添加的CLE的豬尿樣品進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度檢測6次。結(jié)果見表1，該熒光增敏法能夠用于豬尿樣品中苯乙醇胺A的檢定，方法令人滿意。

表1 豬尿樣品種不同添加濃度的HPLC-MS-MS和熒光增敏法測定結(jié)果的比較

Table 1 Comparison of detection results of pork sample by HPLC-MS-MS and Fluorescence enhancing methods

添加水平/(μg·L-1)HPLC-MS-MS測定/(μg·L-1)熒光增敏法測/(μg·L-1)1010±2.310±1.22020±1.620±3.83030±3.130±4.73535±4.235±6.86060±5.260±7.98080±8.980±10.2

3 結(jié) 論

以巰基丙酸作為穩(wěn)定劑，微波輻射合成的CdTe納米材料性能優(yōu)良，粒徑均勻，約4.5 nm, 熒光強(qiáng)度強(qiáng)，量子產(chǎn)率達(dá)52.341%，半峰寬為45 nm?；诒揭掖及稟在一定的條件下，能夠填充CdTe納米材料的表面缺陷，使得體系的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，從而建立一種檢測苯乙醇胺A的熒光增敏方法。苯乙醇胺A在8～120 μg·L-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。其回歸方程為F/F0=0.001 9c+1.032 1，線性相關(guān)系數(shù)為0.996，方法檢出限為3.5 μg·L-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%(n=6)，經(jīng)與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相比，結(jié)果滿意。為苯乙醇胺A的檢測提供一種分析方法。