己酸菌對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

張華東，李霄霄，任雪，張穎，肖冬光

(天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術(shù)工程中心，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457)

己酸菌是一類革蘭氏陰性菌，厭氧或者兼性厭氧[1]，在白酒生產(chǎn)中己酸菌多棲息在窖泥中，己酸菌產(chǎn)生的己酸可以與乙醇酯化成為己酸乙酯，白酒中的己酸乙酯大部分是由乙醇和己酸酯化生成[2]，己酸乙酯是我國濃香型白酒的主體香味成分[3]，己酸菌在濃香型白酒中的地位不言而喻。己酸菌液在灌窖、養(yǎng)護(hù)窖池、做人工窖泥方面都有重要的作用[4,5]。在窖泥中篩選的己酸菌多為克氏梭狀芽孢桿菌，該菌多利用乙醇和乙酸為碳源，丁酸為前體物合成己酸，也有學(xué)者篩選到能利用乳酸為碳源合成己酸的瘤胃菌CBP6菌株[6-8]。

白酒的生產(chǎn)需要眾多微生物菌群的參與，其中酵母菌是酒精發(fā)酵的主體菌，特別是釀酒酵母，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，釀酒酵母在白酒生產(chǎn)過程中逐漸成為優(yōu)勢菌群。有研究表明釀酒酵母可以提高己酸菌的己酸產(chǎn)量[9]，向己酸菌培養(yǎng)基中添加生香酵母有利于己酸菌的生長及代謝[10]。但是，己酸菌的主要代謝產(chǎn)物己酸對(duì)微生物的毒害作用也比較明顯。

白酒生產(chǎn)從本質(zhì)上說就是微生物相互作用的結(jié)果，研究微生物間相互作用對(duì)探究白酒生產(chǎn)機(jī)理及白酒生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)步具有重大意義[11]。實(shí)驗(yàn)室前期通過分子手段獲得了一株高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15，該菌株不僅能夠高產(chǎn)乙酸乙酯和乙酸異戊酯，而且生長及酒精發(fā)酵性能與普通釀酒酵母沒有區(qū)別。將己酸菌與高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15進(jìn)行混合發(fā)酵，研究兩株菌之間的相互作用，探究己酸菌對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響，為高產(chǎn)酯釀酒酵母的實(shí)際應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

己酸菌復(fù)合液：某酒廠提供；高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15(CGMCC No.5635)：天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

硫酸鎂、硫酸銨、磷酸氫二鉀(均為分析純)：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；乙酸鈉、酵母膏、硫酸鎂、硫酸銨、碳酸鈣、乙醇：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；耐高溫α-淀粉酶(1×105U/mL)、糖化酶(2.9×105U/mL)、酸性蛋白酶(5×104U/mL)：諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；玉米粉：購于超市；澳洲高粱：北京紅星二鍋頭有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

己酸菌培養(yǎng)基：乙酸鈉5 g，酵母膏5 g，磷酸氫二鉀0.4 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸銨0.5 g，去離子水1 L，121 ℃高壓滅菌20 min，接菌時(shí)添加2%乙醇和1%經(jīng)干熱滅菌的碳酸鈣。

高產(chǎn)酯釀酒酵母種子培養(yǎng)基：玉米粉與水按1∶4(g/mL)混合，添加耐高溫α-淀粉酶(10 U/g原料)90 ℃水浴1 h，然后繼續(xù)加熱煮沸，維持 30 min，在之后補(bǔ)水至原體積，立即降溫到60 ℃，添加糖化酶(250 U/g原料)在60 ℃水浴4 h，然后用4層紗布過濾，調(diào)節(jié)糖度為12 °Bx，添加硫酸銨6 g/L，硫酸鎂1.2 g/L，磷酸氫二鉀2.4 g/L，115 ℃高溫滅菌20 min備用。

高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基：高粱粉與按水1∶3(g/mL)混合，液化糖化步驟同玉米粉水解液，糖化完成后降溫到40 ℃，添加酸性蛋白酶(30 U/g原料)水浴4 h，然后用4層紗布過濾，在115 ℃高溫滅菌20 min備用。

1.4 主要儀器與設(shè)備

MS204S電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；1200系列高效液相色譜儀、7890B型氣相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；XMTB型電熱恒溫水浴鍋 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)器材有限公司；H1650-W型高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀科技有限公司；BX43型生物顯微鏡 日本OLYMPUS會(huì)社；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 己酸菌菌懸液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母的影響

將4 ℃冰箱保存的己酸菌液按照10%(V/V)的接種量接種到新鮮的己酸菌培養(yǎng)基中，在35 ℃培養(yǎng)96 h，取150 mL培養(yǎng)液，于4 ℃離心，棄掉上清液后添加無菌水補(bǔ)充體積至150 mL重懸菌體，制成己酸菌菌懸液。

將己酸菌菌懸液按照0，5，10，15，20 mL的接種量接種到高粱汁培養(yǎng)基中，高產(chǎn)酯釀酒酵母接種量為10 mL，發(fā)酵總體積為130 mL/250 mL，在30 ℃靜置發(fā)酵72 h。

1.5.2 己酸菌發(fā)酵液對(duì)釀酒酵母的影響

己酸菌厭氧培養(yǎng)9 d，獲得己酸菌發(fā)酵液，離心取上清，上清液過膜除菌，測定己酸含量(9.53 g/L)，然后用己酸發(fā)酵上清液配制含有不同己酸濃度(45，90，150，220 mg/L)的高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基，高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15接種量為10 mL，發(fā)酵總體積為130 mL/250 mL，在30 ℃靜置發(fā)酵72 h。

1.6 分析方法

己酸檢測：將樣品離心并用0.22 μm的濾膜過濾到液相分析小瓶中，使用Agilent 1200SL 液相色譜儀，色譜柱HPX-87H(300 mm×7.8 mm×9 μm)，UV檢測器，流動(dòng)相為5 mmol/L 的硫酸溶液，柱溫為60 ℃，流速為0.6 mL/min，檢測時(shí)間為48 min，進(jìn)樣量為20 μL。

高級(jí)醇、乙酸酯檢測：發(fā)酵液經(jīng)蒸餾后的樣品使用氣相色譜法測定，色譜條件：Agilent 7890B氣相色譜儀，氫火焰離子檢測器(FID)，載氣為高純氮?dú)猓琇ZP930白酒分析專用毛細(xì)管柱(50 m×0.32 mm×0.25 μm)，進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測器溫度230 ℃，氫氣流量40 mL/min,空氣流量300 mL/min，柱流量0.8 mL/min。程序升溫：50 ℃保持8 min，然后以5 ℃/min速率升溫到200 ℃保持5 min。

殘?zhí)堑臏y定：斐林試劑法[12]。

高產(chǎn)酯釀酒酵母RNA提?。喝“l(fā)酵對(duì)數(shù)期的發(fā)酵液2 mL，在4 ℃條件下以12000 r/min高速離心3 min，棄掉上清液，立即放入液氮中冷凍2 min，然后立即放入-80 ℃冰箱中備用。高產(chǎn)酯釀酒酵母RNA由諾禾致源生物信息科技有限公司提取。

2 結(jié)果與分析

2.1 己酸菌菌懸液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

表1 己酸菌菌懸液不同添加量下MY-15的CO2排放量Table 1 CO2 emission load of MY-15 under different additive amount of caproic acid bacteria suspension g

釀酒酵母在限氧條件下，在酒化酶的作用下將葡萄糖發(fā)酵生成酒精和二氧化碳[13]，二氧化碳失重變化可以反映釀酒酵母的發(fā)酵速度，發(fā)酵過程中每隔12 h稱重一次。由表1可知，與對(duì)照相比，己酸菌菌懸液各添加量下高產(chǎn)酯釀酒酵母的發(fā)酵速度沒有受到影響，總失重都在9.1～9.3 g之間。

表2 己酸菌菌懸液不同添加量下高產(chǎn)酯釀酒酵母理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical indices of Saccharomyces cerevisiae with high-yield ester under different additive amount of caproic acid bacteria suspension

續(xù) 表

由表2可知，添加己酸菌菌懸液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母酯醇代謝及酒精發(fā)酵沒有直接影響，主要原因可能是高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基不適合己酸菌生長代謝，或者是與發(fā)酵時(shí)間過短有關(guān)系。

2.2 己酸菌發(fā)酵液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

圖1 不同己酸濃度下高產(chǎn)酯釀酒酵母的CO2排放量Fig.1 CO2 emission load of Saccharomyces cerevisiae with high-yield ester under different additive amount of caproic acid

由圖1可知，隨著高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)己酸濃度的升高(0～220 mg/L己酸)，高產(chǎn)酯釀酒酵母的發(fā)酵速度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)己酸濃度為90，150 mg/L時(shí)，高產(chǎn)酯釀酒酵母的發(fā)酵速度有明顯提高，說明培養(yǎng)基內(nèi)含有適量的己酸菌發(fā)酵液能促進(jìn)高產(chǎn)酯釀酒酵母的生長。

由圖2可知，培養(yǎng)基內(nèi)己酸濃度為45～220 mg/L時(shí)，高產(chǎn)酯釀酒酵母發(fā)酵72 h后的乙醇有略微提高，在己酸濃度為220 mg/L時(shí)高產(chǎn)酯釀酒酵母的乙醇為81.13 g/L，比己酸濃度為0 mg/L時(shí)增加了6.64%。發(fā)酵72 h后的殘?zhí)浅尸F(xiàn)降低的趨勢，在己酸濃度為0，45，90，150，220 mg/L時(shí)，殘?zhí)欠謩e為5.4，5.3，5.2，5，5 g/L。說明培養(yǎng)基內(nèi)含有少量己酸菌代謝產(chǎn)物可以促進(jìn)高產(chǎn)酯釀酒酵母的乙醇代謝。

圖2 不同己酸濃度下高產(chǎn)酯釀酒酵母的乙醇及殘?zhí)遣町怓ig.2 Differences in ethanol and residual sugar content of Saccharomyces cerevisiae with high-yield ester under different concentration of caproic acid

圖3 不同己酸濃度下高產(chǎn)酯釀酒酵母主要風(fēng)味物質(zhì)含量Fig.3 Content of main flavor substances in Saccharomyces cerevisiae with high-yield ester under different concentration of caproic acid

由圖3可知，培養(yǎng)基內(nèi)的己酸濃度微量時(shí)(45 mg/L)對(duì)釀酒酵母酯醇代謝的影響很大，乙酸乙酯分別下降39.18%、55.1%、56.35%、65.32%。乙酸異丁酯在己酸濃度為45 mg/L時(shí)下降78.57%，己酸濃度為90 mg/L時(shí)，乙酸異丁酯含量下降91.32%，在己酸濃度為150，220 mg/L時(shí)沒有檢測到乙酸異丁酯。乙酸異戊酯含量也隨著培養(yǎng)基內(nèi)己酸濃度的升高而降低，分別下降64.28%、78.05%、80.79%、82.14%。正丙醇含量在己酸濃度為220 mg/L時(shí)變化最大，下降了65.85%，在其他己酸濃度下正丙醇分別下降10.24%、7.07%、18.55%。異丁醇在培養(yǎng)基己酸濃度為45，90，150，220 mg/L時(shí)分別下降32.43%、48.64%、56.76%、58.13%。異戊醇在培養(yǎng)基己酸濃度為45，90，150，220 mg/L時(shí)分別下降18.75%、58.03%、67.85%、67.55%。隨著培養(yǎng)基內(nèi)己酸濃度的增加，苯乙醇的含量下降最為明顯，在己酸濃度為45 mg/L時(shí)，苯乙醇已經(jīng)下降了77.46%，在培養(yǎng)基己酸濃度為90，150，220 mg/L時(shí)分別下降92.95%、92.97%、94.36%。活性戊醇在培養(yǎng)基己酸濃度為45，90，150，220 mg/L時(shí)分別下降27.27%、69.09%、76.36%、85.47%。

2.3 己酸菌代謝產(chǎn)物對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母轉(zhuǎn)錄組的影響

選取己酸濃度為220 mg/L為實(shí)驗(yàn)組(編號(hào)Cap)，不添加己酸濃度的為對(duì)照組(編號(hào)MY-15)。對(duì)數(shù)期取樣送達(dá)諾禾致源生物有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

火山圖可直觀展示每個(gè)比較組合的差異基因分布情況，見圖4。圖4中橫坐標(biāo)表示基因在處理和對(duì)照兩組中的表達(dá)倍數(shù)變化(log2 Fold Change)，縱坐標(biāo)表示基因在處理和對(duì)照兩組中表達(dá)差異的顯著性水平。右側(cè)1.301域值線表示上調(diào)基因數(shù)，左側(cè)1.301域值線表示下調(diào)基因數(shù)，域值線以下表示沒有明顯變化的基因數(shù)。

由圖4可知，在培養(yǎng)基內(nèi)含有己酸菌代謝產(chǎn)物時(shí)(己酸濃度為220 mg/L)，高產(chǎn)酯釀酒酵母共有1032個(gè)基因上調(diào)，有1037個(gè)基因下調(diào)。

圖4 差異基因火山圖Fig.4 Differential gene volcano map

GO(Gene Ontology，基因本體)是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫，主要是利用基因的本質(zhì)功能對(duì)基因進(jìn)行分類，從而限定和描述基因和蛋白質(zhì)的功能。GO數(shù)據(jù)庫把基因的本體分為3種：生物過程(Biological Process，BP)、細(xì)胞組成(Cellular Component，CC)和分子功能(Molecular Function,MF)。從GO富集分析結(jié)果中，選取最顯著的30個(gè)Term繪制柱狀圖進(jìn)行展示，若不足30個(gè)，則繪制所有Term，見圖5。圖5中橫坐標(biāo)為GO Term，縱坐標(biāo)為GO Term富集的顯著性水平，數(shù)值越高越顯著，從左到右分別代表BP、CC、MF 3個(gè)GO子類。

圖5 GO富集分析柱狀圖Fig.5 GO enrichment analysis histogram

由圖5可知，添加己酸菌代謝產(chǎn)物后，主要影響了翻譯、肽生物合成過程、酰胺生物合成過程、細(xì)胞酰胺代謝過程、肽代謝過程、有機(jī)氮化合物生物合成工藝、有機(jī)氮化合物代謝過程、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程、蛋白質(zhì)代謝過程、細(xì)胞復(fù)合氮生物合成過程、細(xì)胞大分子生物合成過程等生物過程；主要影響了核糖體、細(xì)胞內(nèi)核糖核蛋白復(fù)合物、核糖核蛋白復(fù)合物、無膜細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)無膜細(xì)胞器、細(xì)胞質(zhì)部分、高分子絡(luò)合物、細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞組成等；主要影響了核糖體的結(jié)構(gòu)組成、結(jié)構(gòu)分子活性等分子功能。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書)，是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫。從KEGG富集結(jié)果中，選取最顯著的20個(gè)KEGG通路繪制散點(diǎn)圖進(jìn)行展示，見圖6。圖6中橫坐標(biāo)為注釋到KEGG通路上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標(biāo)為KEGG通路，點(diǎn)的大小代表注釋到KEGG通路上的基因數(shù)。

圖6 KEGG富集散點(diǎn)圖Fig.6 KEGG enrichment scatter plot

由圖6可知，添加己酸菌發(fā)酵液至培養(yǎng)基中己酸濃度為220 mg/L時(shí)，與不添加己酸菌發(fā)酵液相比，高產(chǎn)酯釀酒酵母的核糖體、苯丙氨酸代謝、糖酵解、碳代謝、氧化磷酸化、酪氨酸代謝、氨基酸的生物合成、2-氧羧酸代謝過程受到顯著影響。

3 結(jié)論

己酸菌菌懸液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母的生長、酒精發(fā)酵及酯醇代謝沒有直接影響，但是己酸菌的代謝產(chǎn)物對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母的影響顯著，少量己酸濃度(90～220 mg/L)能促進(jìn)高產(chǎn)酯釀酒酵母的生長及酒精發(fā)酵，酒精產(chǎn)量最多提高了6.63%，但是在己酸濃度為45～220 mg/L時(shí)，高產(chǎn)酯釀酒酵母的乙酸酯和主要高級(jí)醇的代謝被顯著抑制，且隨著己酸濃度的提高，抑制作用越來越強(qiáng)烈。

將己酸濃度為220 mg/L的高產(chǎn)酯釀酒酵母與不添加己酸的高產(chǎn)酯釀酒酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序表明，高產(chǎn)酯釀酒酵母共有1032個(gè)基因上調(diào)，有1037個(gè)基因下調(diào)，主要涉及到高產(chǎn)酯釀酒酵母的氮代謝、糖酵解、苯丙氨酸代謝、碳代謝等生物過程。