當(dāng)量生物素控制對谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸的影響

熊海波，梅漫莉，徐慶陽,2,3*

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室， 天津 300457；3.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

L-異亮氨酸是人體必需的氨基酸，同時又是3種支鏈氨基酸之一[1]，因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能，在人類生命代謝中具有極其重要的地位[2,3]。異亮氨酸是人體激素、蛋白質(zhì)合成和能量生成的原料，在細(xì)胞膜的跨膜運(yùn)輸中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[4]。同時作為食品添加劑，可調(diào)節(jié)食品中的氨基酸平衡，因此，被廣泛應(yīng)用于食品與醫(yī)藥等行業(yè)，具有巨大的商業(yè)價值[5]。日本在L-異亮氨酸產(chǎn)量、品質(zhì)和技術(shù)水平上均居世界領(lǐng)先地位，2018年，全球生產(chǎn)L-異亮氨酸的主要廠家日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵、田邊制藥以及德國的Degussa均以發(fā)酵方式為主，其中，日本味之素占據(jù)了全球醫(yī)藥及食品用氨基酸市場份額的60%[6-8]。中國L-異亮氨酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)起步較晚，技術(shù)水平落后，糖酸轉(zhuǎn)化率低，發(fā)酵副產(chǎn)物較多，后期分離提取困難，因此在國際上行業(yè)競爭能力相對較弱[9]，但隨著20世紀(jì)90年代中國氨基酸市場的開放，國內(nèi)發(fā)酵行業(yè)迅猛發(fā)展，目前中國已經(jīng)成為氨基酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)大國[10,11]。微生物要大量積累L-異亮氨酸，必須使代謝調(diào)節(jié)異常化，這種代謝調(diào)節(jié)異常化的細(xì)胞對環(huán)境條件是敏感的，所以需要優(yōu)化發(fā)酵條件[12]。當(dāng)前，微生物發(fā)酵法產(chǎn)異亮氨酸主要以大腸桿菌作為工程菌株，但大腸桿菌發(fā)酵控制條件復(fù)雜，易受噬菌體侵染，且副產(chǎn)物纈氨酸產(chǎn)量較高，分離提取困難。為解決上述問題，提高L-異亮氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率，保證菌種產(chǎn)酸的穩(wěn)定性，本研究以谷氨酸棒桿菌YILM 1504為供試菌株，以生物素為唯一變量，確定了發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸過程中最適生物素添加量及中后期補(bǔ)料工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamate)YILM 1504：由天津科技大學(xué)代謝工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基配方

種子培養(yǎng)基配方：葡萄糖25 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO45 g/L，(NH4)2SO45 g/L，酵母浸粉5 g/L[13]，玉米漿干粉20 g/L，VH0.1 mg/L，VB10.3 mg/L，消泡劑 0.2 g/L,用NaOH調(diào)節(jié)pH到4.5～5之間，種子發(fā)酵罐培養(yǎng)用氨水調(diào)節(jié)并維持pH到6.7～7.0之間。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方：葡萄糖80 g/L，MgSO40.8 g/L，KH2PO41.6 g/L，(NH4)2SO45 g/L， 玉米漿干粉(10，20，30，40 g/L，即15，30，45，60 μg/L),VB10.3 g/L，豆餅水解液10 mL/L,賴氨酸0.2 g/L，蛋氨酸0.2 g/L，培養(yǎng)基pH用NaOH調(diào)節(jié)到4.5～5之間，發(fā)酵培養(yǎng)過程中pH用氨水調(diào)節(jié)并維持到6.7～7.0之間。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZH-100KBS型全自動立式蒸汽滅菌器 天津博鑫生物科技有限公司；5 L自動控制發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；SBA-40E 生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所；Agilent 1200高效液相色譜儀 Agilent Technologies公司；KQ-C 高壓蒸汽發(fā)生器 上海奉賢協(xié)新機(jī)電廠；752分光光度計 上海分析儀器廠；Olympus生物顯微鏡 日本Olympus 會社。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱中取出谷氨酸棒桿菌Corynebacteriumglutamate)YILM 1504保菌管，在無菌間傳兩根斜面試管，32 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)活化24 h，活化后的菌株再傳2個200 mL茄形瓶，繼續(xù)32 ℃培養(yǎng)24 h，保持菌株旺盛的活力[14]。

2 L種子發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐接種3 L，32 ℃，維持pH在 6.7～7.0。初始通風(fēng)2.0 L/min，初始罐壓小于0.05 MPa，初始轉(zhuǎn)速200 r/min，種子培養(yǎng)時間16 h，期間轉(zhuǎn)速逐步調(diào)節(jié)到400 r/min，其他條件不變，OD600大于20×0.8可接發(fā)酵培養(yǎng)。

3 L發(fā)酵培養(yǎng)，種子罐留600 mL種子液，添加發(fā)酵培養(yǎng)基，定容到3 L，發(fā)酵液連續(xù)培養(yǎng)46 h。溫度32 ℃，pH 6.7～7.0，溶氧保持在30～40之間，轉(zhuǎn)速由200 r/min逐步提高到900 r/min。通風(fēng)量由2.0 L/min逐步提升到6.0 L/min。16 h后測殘?zhí)牵骷?0%(體積分?jǐn)?shù))的葡萄糖，維持罐內(nèi)殘?zhí)窃?0～20 g/L之間。中間添加適量消泡劑消除泡沫[15]。

1.3.2 梯度濃度生物素添加對比實(shí)驗(yàn)

5 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵培養(yǎng)基其他條件不變，10，20，30，40 g/L玉米漿換算成生物素添加量分別為15，30，45，60 μg/L。設(shè)置4個生物素添加量梯度，每個梯度3批實(shí)驗(yàn)，探究生物素濃度對菌體量、產(chǎn)酸和副產(chǎn)物的影響。

1.3.3 直接添加與分批流加生物素對比實(shí)驗(yàn)

5 L發(fā)酵罐中，分批流加實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件與底料直接添加生物素相同，但分批流加生物素實(shí)驗(yàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)期間，分別在18，32，42 h添加10 g/L的玉米漿(15 μg/L的生物素)。每個實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個批次，探究流加生物素對菌體量及產(chǎn)酸的影響。

L-異亮氨酸發(fā)酵初期為0～18 h，中期為18～32 h，后期為42～56 h，發(fā)酵間期指整個發(fā)酵過程，為0～56 h。圖6中初期添加指直接添加實(shí)驗(yàn)，間期補(bǔ)加指分批流加實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 玉米漿干粉處理方法

用鐵鍋稱取800 g玉米漿干粉，添加2 g消泡劑，溶于2.1 L水中，電磁爐240 ℃煮40 min，得到的玉米漿濃液，冷卻后定容到2 L，制備成40%玉米漿液體備用。

普通玉米漿本身富含糖、氮和微生物生長無機(jī)微量元素和有機(jī)因子，保存不當(dāng)容易滋生雜菌，導(dǎo)致酸敗變質(zhì)，使其成分有較大的波動。而玉米漿干粉為超低溫噴霧干燥的固體顆粒，內(nèi)在質(zhì)量比普通液體玉米漿質(zhì)量穩(wěn)定(有效活性成分均一而穩(wěn)定)可控，從而使生物發(fā)酵的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性保持良好。該實(shí)驗(yàn)使用玉米漿干粉為保齡寶生物股份有限公司生產(chǎn)，每1 g 40%玉米漿溶液中含有1.5 μg生物素。

1.3.5 異亮氨酸及副產(chǎn)物檢測

發(fā)酵液中只檢測到丙氨酸一種主要副產(chǎn)物，因此只需測L-異亮氨酸和丙氨酸含量。

發(fā)酵期間，用紙層析法初步檢測產(chǎn)酸量，發(fā)酵結(jié)束后用高效液相色譜精密檢測產(chǎn)酸量及副產(chǎn)物含量。

紙層析法：點(diǎn)樣1 μL樣品與標(biāo)品，展開劑為正丁醇∶冰醋酸∶水為4∶1∶2，展開時間20 min，結(jié)束后晾干，茚三酮顯色，然后置于80 ℃烘箱中干燥30 s即呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，對比顏色深淺、斑點(diǎn)大小，得出濃度。

高效液相色譜：發(fā)酵液中L-異亮氨酸和丙氨酸濃度用高效液相色譜法測定。采用Agilent C18( 15 mm×4.6 mm，3.5 μm) 色譜柱，衍生劑為2，4-二硝基氟苯，柱前衍生，流動相為50%的乙腈、4.1 g/L 的醋酸鈉溶液，柱溫33 ℃，流速1 mL/min，檢測波長360 nm[16]。

1.3.6 pH的測定

采用pH 6.4～8.0精密pH試紙測定。

1.3.7 殘?zhí)呛繖z測

每2 h取樣離心，留上清。用SBA生物傳感分析儀檢測殘?zhí)呛俊?/p>

1.3.8 菌體量檢測

每2 h取樣，分別稀釋10，20，100倍，用紫外可見分光光度計測量OD600。

菌體生物量=吸光值OD600×稀釋倍數(shù)。

注：吸光值范圍在0.2～0.8，超過量程后需換下一個稀釋倍數(shù)。

1.3.9 pH在線檢測

發(fā)酵罐自帶的梅特勒pH在線檢測，用pH試劑進(jìn)行放液驗(yàn)證檢測。培養(yǎng)基pH控制，可用梅特勒電導(dǎo)率儀精密檢測。

1.3.10 計算方法

糖酸轉(zhuǎn)化率(%)=發(fā)酵液中L-異亮氨酸質(zhì)量濃度(g/L)×發(fā)酵液總體積(L)/總耗糖量(g)×100%。

每個實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別取3個數(shù)的平均值，進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物素濃度對菌體濃度及產(chǎn)酸的影響

圖1 生物素濃度對菌體濃度的影響Fig.1 Effect of biotin concentration on thallus concentration

對于L-異亮氨酸而言，較高生物素有利于菌體生長和L-異亮氨酸積累。生物素是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的輔基，通過促進(jìn)CO2的固定能把碳架流導(dǎo)向合成L-異亮氨酸的途徑，但過高的生物素對產(chǎn)酸也會產(chǎn)生不利的效果。玉米漿中含有豐富的生物素及速效氮源，通過添加玉米漿控制生物素含量。在5 L發(fā)酵罐中，選擇在發(fā)酵初期分別一次性添加10，20，30，40 g/L玉米漿(15，30，45，60 μg/L的生物素)，通過多批次生物素濃度對比實(shí)驗(yàn)，在忽略初始接種種子濃度的情況下，生物素濃度越高，菌體生長越迅速。由圖1可知，當(dāng)生物素濃度處于低適量的情況下，生物素濃度的提高對菌體濃度的增長呈階梯式增長，在生物素濃度為15，30，45 μg/L的5 L發(fā)酵罐中，菌體最高濃度OD600分別是101.5，108，124。而當(dāng)生物素濃度提高到60 μg/L時，菌體量爆發(fā)式增長，最高OD600可達(dá)到368，高生物素的發(fā)酵環(huán)境下，菌體生長速度激增，可見生物素濃度對菌體的生長影響很大。

圖2 生物素濃度對L-異亮氨酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of biotin concentration on L-isoleucine yield

低適量生物素濃度下，生物素濃度的增加與菌體濃度、異亮氨酸產(chǎn)量呈正相關(guān)。在15～45 μg/L的生物素濃度范圍內(nèi)，產(chǎn)酸量分別是29.5，35，42.5 g/L。在高濃度的生物素發(fā)酵液中，微生物的產(chǎn)酸量較低。由圖2可知，當(dāng)生物素濃度達(dá)到60 μg/L時，發(fā)酵產(chǎn)酸量為22 g/L。在第24 h才開始快速產(chǎn)酸，高速產(chǎn)酸期延后了8 h，同時菌體量的快速增長消耗了培養(yǎng)基中大部分的營養(yǎng)物質(zhì)，再加上后期不利物質(zhì)的積累，第42 h時，菌體提前進(jìn)入衰退期，產(chǎn)酸進(jìn)入停滯階段。高濃度的生物素為細(xì)胞膜的生長提供了動力，在其他微生物所必需的營養(yǎng)物質(zhì)都豐富的條件下，生物素濃度越高，微生物的生長情況越好，菌體量越高，但微生物細(xì)胞膜的完整性越好，細(xì)胞膜的通透性越低，異亮氨酸的分泌越困難，胞內(nèi)終產(chǎn)物阻遏越強(qiáng)，對代謝途徑中關(guān)鍵酶的反饋越強(qiáng)，抑制異亮氨酸的合成，最終導(dǎo)致胞外發(fā)酵液中異亮氨酸濃度較低。異亮氨酸作為必需氨基酸的一種，同樣是微生物生長的必要成分，谷棒菌株在合成異亮氨酸的同時，同樣從發(fā)酵液中吸收并利用異亮氨酸合成自身所需的物質(zhì)。

2.2 生物素濃度對耗糖速率及糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

圖3 生物素濃度對耗糖速率的影響Fig.3 Effect of biotin concentration on sugar consumption rate

谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸，葡萄糖為主要碳源，其消耗主要有兩部分組成：一部分提供細(xì)胞生長與自身繁殖的能量與碳骨架，另一部分由細(xì)胞合成與分解成各種氨基酸、核苷酸、脂肪酸等中間代謝體。由圖3可知，在10，20，30，40 g/L玉米漿(15，30，45，60 μg/L的生物素)的5 L發(fā)酵罐中，初始培養(yǎng)基中糖濃度都是80 g/L，隨著發(fā)酵開始，微生物耗糖速率隨生物素添加量的增加而加快，在18～24 h之間達(dá)到谷氨酸棒桿菌產(chǎn)酸的最佳糖濃度。谷氨酸棒桿菌的生長與產(chǎn)酸是非同步關(guān)系，在8 h以前微生物主要以自身生長與繁殖為主，隨著微生物濃度的增加，耗糖速率緩慢增加；在發(fā)酵8 h左右，微生物進(jìn)入分裂對數(shù)期，同時開始產(chǎn)酸，耗糖快速上升；當(dāng)達(dá)到20 h后，細(xì)胞濃度達(dá)到最大值并保持穩(wěn)定不變，產(chǎn)酸進(jìn)入穩(wěn)定期，耗糖速率基本保持穩(wěn)定；40 h后，隨著發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗和副產(chǎn)物的積累，發(fā)酵進(jìn)入后期，微生物濃度和產(chǎn)酸量下降，耗糖速率降低。

表1 不同生物素發(fā)酵參數(shù)對比Table 1 Comparison of fermentation parameters of different biotin

由表1可知，生物素的添加量影響微生物的菌體濃度和產(chǎn)酸量，在低適量下，生物素濃度越高，細(xì)胞生長越快，菌體量越高，產(chǎn)酸越快，耗糖速率越快，糖酸轉(zhuǎn)化率越高；在高濃度生物素添加量下，隨著生物素的增加，營養(yǎng)物質(zhì)大部分用于微生物的生長，產(chǎn)酸期延后，產(chǎn)酸低，糖耗高，糖酸轉(zhuǎn)化率底。

2.3 生物素濃度對副產(chǎn)物的影響

異亮氨酸合成流程圖見圖4。

圖4 異亮氨酸合成流程圖Fig.4 Flow chart of isoleucine synthesis

注：PC為磷酸烯醇式丙酮酸酶；AK為天冬氨酸激酶；HD為高絲氨酸脫氫酶；TD為蘇氨酸脫水酶；AS為酰羥基酸合成酶；HT為高絲氨酸激酶。

圖5 不同生物素濃度發(fā)酵對丙氨酸的影響Fig.5 Effects of fermentation with different biotin concentration on alanine

本實(shí)驗(yàn)使用的谷氨酸棒桿菌為賴氨酸、蛋氨酸缺陷菌株，從液相檢測可以看出，副產(chǎn)物主要為丙氨酸。從代謝流分析得出，葡萄糖一部分經(jīng)過EMP途徑分解合成丙酮酸再合成丙氨酸，另一部分經(jīng)過EMP途徑合成磷酸烯醇式丙酮酸，再經(jīng)過TCA循環(huán)合成天冬氨酸，再合成丙氨酸。在整個異亮氨酸合成途徑中，合成天冬氨酸之前的所有途徑相同，所以低適量生物素發(fā)酵過程中，隨著生物素濃度的增加，異亮氨酸的合成增加，丙氨酸含量也隨之增加。L-異亮氨酸的生產(chǎn)和丙氨酸的生成為協(xié)同增效。在高濃度生物素添加量發(fā)酵過程中，細(xì)胞膜完整，對氨基酸運(yùn)出細(xì)胞膜也有一定的影響。由圖5可知丙氨酸最高為9 g/L。

2.4 分批流加玉米漿對產(chǎn)酸的影響

圖6 發(fā)酵間期補(bǔ)加玉米漿對菌體濃度的影響Fig.6 Effect of corn syrup supplementation on thallus concentration during fermentation

圖7 發(fā)酵間期補(bǔ)加玉米漿對L-異亮氨酸的影響Fig.7 effect of corn syrup supplementation on L-isoleucine during fermentation

從上述分析可以得出，高濃度生物素添加量發(fā)酵不利于菌體產(chǎn)酸，對于這種情況，本實(shí)驗(yàn)通過分批流加生物素技術(shù)，在發(fā)酵期間補(bǔ)加生物素，解決了這個難題。分批式添加生物素，在總體玉米漿濃度50 g/L(生物素濃度75 μg/L)不變的情況下，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20 g/L玉米漿(30 μg/L生物素)，在發(fā)酵18，32，42 h分別補(bǔ)加10 g/L玉米漿(15 μg/L生物素)。由圖6和圖7可知，在發(fā)酵18 h以前，玉米漿中的速效氮源使菌體生長迅速，同時生物素濃度為30 μg/L，處于低適量生物素添加量，菌體轉(zhuǎn)型時間點(diǎn)提前，轉(zhuǎn)型時間由14～18 h提前到10～14 h，菌體轉(zhuǎn)型快，產(chǎn)酸量高；到18 h以后，大部分菌體已經(jīng)轉(zhuǎn)型成功，細(xì)胞膜完整性差，轉(zhuǎn)變成有利于異亮氨酸的積累和胞外分泌的新模式，底料生物素基本被消耗，此時添加少量玉米漿，補(bǔ)充生物素及速效氮源，細(xì)胞菌體量進(jìn)一步增加，同時低適量生物素?zé)o法使細(xì)胞膜修復(fù)完整，細(xì)胞膜仍處于缺陷狀態(tài)，而補(bǔ)加的速效氮源，有利于菌體生長和異亮氨酸分泌；32 h和42 h生物素再次被消耗完，此時添加玉米漿可保持菌體量濃度不變或下降速度變緩，延長產(chǎn)酸時間，提高轉(zhuǎn)化率。產(chǎn)量達(dá)到了44.5 g/L，比初始生物素濃度為30 μg/L，后期不補(bǔ)料產(chǎn)酸量提高了49.8%。

異亮氨酸發(fā)酵的高效產(chǎn)酸關(guān)鍵在于控制發(fā)酵前中期谷氨酸棒桿菌細(xì)胞膜在結(jié)構(gòu)和功能上的特異性轉(zhuǎn)變[17]，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，從而形成有利于異亮氨酸胞內(nèi)積累與胞外分泌的新模式[18-21]。這就需要掌握異亮氨酸高產(chǎn)菌株的發(fā)酵特性以及該菌株特異型轉(zhuǎn)變的周期與細(xì)胞轉(zhuǎn)型的關(guān)鍵時間點(diǎn)。生物素小分子在參與羧化作用時，能夠結(jié)合羧基，參與菌體內(nèi)固定 CO2的羧化反應(yīng)；作為乙酰CoA的輔酶，參與磷脂的合成和細(xì)胞膜的組成，最終影響目的產(chǎn)物的合成與分泌[22]。在發(fā)酵初期，罐內(nèi)生物素對于菌體來說是過量的，在營養(yǎng)成分豐富的情況下，細(xì)胞進(jìn)入快速生長分裂階段。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入中期(18 h)后，罐內(nèi)生物素對于菌體處于亞適量狀態(tài)，菌體生長緩慢，細(xì)胞膜合成不足，封閉性減弱，通透性增加，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換能力增強(qiáng)，有利于L-異亮氨酸分泌于胞外[23]。細(xì)胞內(nèi)L-異亮氨酸濃度降低，解除終產(chǎn)物反饋抑制，細(xì)胞大量合成L-異亮氨酸。玉米漿在氨基酸發(fā)酵中為菌體提供氮源和生長因子，尤其是其中的生物素和限制性氨基酸的含量對發(fā)酵結(jié)果影響巨大[24]。本研究通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度玉米漿的方式控制生物素的添加量，同時，玉米漿中豐富的氨基酸為菌體的轉(zhuǎn)氨作用提供了原料，促進(jìn)了異亮氨酸的合成。生物素的亞適量工藝目前已普遍應(yīng)用于谷氨酸、纈氨酸、亮氨酸等各類氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本研究通過限制生物素濃度探究谷氨酸棒桿菌YILM 1504產(chǎn)L-異亮氨酸的最適生物素濃度。5 L發(fā)酵罐中，在發(fā)酵液中生物素處于低適量條件下，隨著生物素濃度的增加，菌體濃度增加，耗糖速率加快，產(chǎn)酸量高，糖酸轉(zhuǎn)化率高；經(jīng)過多批次對比實(shí)驗(yàn)，得出最適生物素濃度為45 μg/L，此時產(chǎn)酸達(dá)到42.5 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高，為13.4%；在高濃度生物素發(fā)酵液中，生物素的增加只會增加菌體濃度，不利于異亮氨酸發(fā)酵。為了解決了高濃度生物素發(fā)酵中后期菌體活力低而造成產(chǎn)酸低的問題，在發(fā)酵前期控制生物素濃度為30 μg/L，保持低適量生物素，有利于發(fā)酵前期細(xì)胞轉(zhuǎn)型；中期在18 h向發(fā)酵液中添加10 g/L玉米漿(15 μg/L生物素)，保持少量的生物素，有利于增加轉(zhuǎn)型細(xì)胞濃度，提高產(chǎn)酸速率；后期在32，42 h繼續(xù)補(bǔ)加玉米漿，維持細(xì)胞濃度，延長高速產(chǎn)酸時間，提高糖酸轉(zhuǎn)化率，降低成本；54 h產(chǎn)酸量達(dá)到了44.5 g/L，比初始生物素濃度為30 μg/L，后期不補(bǔ)料產(chǎn)酸量提高了49.8%。