G蛋白偶聯(lián)受體MrgprD研究進(jìn)展及對(duì)中醫(yī)藥研究的啟示

王地均，金香，唐宗湘，王長(zhǎng)明

(南京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

MrgprD(又名MrgD，TGR7)是具有7個(gè)跨膜蛋白的G蛋白偶聯(lián)受體[1-2]。編碼小鼠MrgprD的基因位于第7號(hào)染色體[3]，編碼人MrgprD的基因位于第11號(hào)染色體[2]。MrgprD主要表達(dá)于外周背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元上，占整個(gè)DRG神經(jīng)元數(shù)量的30%[1]。近幾年的研究認(rèn)為β-丙氨酸(β-alanine)是MrgprD特異性激動(dòng)劑[2-4]，但是只激活50% MrgprD陽(yáng)性的DRG神經(jīng)元[3]。最初的研究認(rèn)為MrgprD可能參與了疼痛的產(chǎn)生，并認(rèn)為MrgprD陽(yáng)性的神經(jīng)元占整個(gè)植物凝集素B4(IB4，非肽能神經(jīng)元標(biāo)記物)陽(yáng)性神經(jīng)元的70%[1,3]。MrgprD也參與了癢覺(jué)的產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)β-丙氨酸激活MrgprD產(chǎn)生的癢是一種非組胺依賴的癢[4]。也有研究認(rèn)為MrgprD和腫瘤的產(chǎn)生有關(guān)[5]，該受體也是腎素-血管緊張素受體的成員，參與了血管的收縮[6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)了MrgprD參與神經(jīng)病理性疼痛的新機(jī)制[7]，過(guò)去的研究認(rèn)為MrgprD在痛覺(jué)、癢覺(jué)和腫瘤產(chǎn)生也有重要作用，因此我們將綜述MrgprD的研究現(xiàn)狀，為我們認(rèn)識(shí)MrgprD的功能并為相關(guān)疾病治療提供參考。

1 MrgprD的發(fā)現(xiàn)

2001年Dong發(fā)現(xiàn)外周感覺(jué)神經(jīng)元表達(dá)一系列的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)，命名為Mrgs，包括MrgA、MrgB、MrgC、MrgprD、MrgE、MrgF、MrgG幾組成員。這些蛋白質(zhì)具有相似的功能，其中一個(gè)成員MrgprD又命名為MrgD，特異性表達(dá)于傷害性感覺(jué)神經(jīng)元上，主要是非肽能神經(jīng)元(IB4陽(yáng)性)，并且表達(dá)P2X3[1]。小鼠MrgprD基因位于第7號(hào)染色體，含有2個(gè)外顯子，全長(zhǎng)9 252 bp，mRNA編碼含321個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)[1,8]。人MrgprD基因位于第11號(hào)染色體上(11q13.3)，含有1個(gè)外顯子，全長(zhǎng)1 160 bp，mRNA編碼含321個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)[1,8]。MrgprD受體是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)依賴c-Ret陽(yáng)性神經(jīng)元，小鼠MrgprD陽(yáng)性的神經(jīng)元是TRPV1陰性，但在大鼠卻是部分TRPV1陽(yáng)性的[8]。研究人員發(fā)現(xiàn)MrgprD受體的特異性激動(dòng)劑β-丙氨酸可以激活TGR7受體即MrgprD[2]。隨后的研究也證實(shí)了MrgprD的特異性激動(dòng)劑是β-丙氨酸[3-4,9-12]。但是MrgprD陽(yáng)性的神經(jīng)元只占DRG神經(jīng)元的30%，β-丙氨酸只能激活MrgprD陽(yáng)性神經(jīng)元的50%[3]。2005年Zylka等通過(guò)EGFP替代了小鼠MrgprD基因，生成了MrgprD基因敲除小鼠[13]，為我們研究MrgprD提供了研究工具。

2 MrgprD的分子生物學(xué)功能

2.1 MrgprD參與疼痛的產(chǎn)生

最初的研究發(fā)現(xiàn)MrgprD表達(dá)于外周傷害性感覺(jué)神經(jīng)元上，認(rèn)為MrgprD和疼痛的產(chǎn)生有關(guān)[1]。后期研究揭示了MrgprD分布及表達(dá)特性，MrgprD陽(yáng)性的神經(jīng)元主要是非肽能神經(jīng)元，占IB4陽(yáng)性神經(jīng)元的76%，這些神經(jīng)元發(fā)出的神經(jīng)纖維都是無(wú)髓鞘的神經(jīng)纖維，外周組織主要表達(dá)于皮膚的表皮層[13]。然而MrgprD如何和痛覺(jué)產(chǎn)生相關(guān)并不清楚，有研究認(rèn)為MrgprD激活后抑制了KCNQ2/3鉀通道，增加了背根神經(jīng)元(DRG)神經(jīng)元的興奮性[9]。多數(shù)傷害性感受器都是多功能的，能接受多種不同的疼痛刺激，如熱痛覺(jué)、機(jī)械性痛覺(jué)、冷痛覺(jué)等。研究發(fā)現(xiàn)MrgprD基因敲除小鼠在炎性痛模型中表現(xiàn)為對(duì)機(jī)械性傷害刺激的感受缺失，但是對(duì)冷刺激和熱刺激的感受都無(wú)差異[14]。研究者推測(cè)，MrgprD基因敲除小鼠在出生后可能會(huì)有一些其他蛋白質(zhì)替代MrgprD的功能。因此，研究者把白喉毒素受體(DTR)插入到MrgprD基因的位置，通過(guò)注射白喉毒素條件性刪除表達(dá)MrgprD陽(yáng)性的神經(jīng)元。研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)MrgprD的神經(jīng)纖維可以快速的感受機(jī)械性刺激[15]。在體實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，表達(dá)MrgprD的神經(jīng)纖維能感受捏或夾引起的刺激而不是輕撫引起的感覺(jué)，因此這種機(jī)械感覺(jué)和情感無(wú)關(guān)[16]。因此，一般認(rèn)為MrgprD是一種和機(jī)械性感覺(jué)相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體。

MrgprD在腸道中表達(dá)，其中腸道巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞表達(dá)MrgprD可能也和內(nèi)臟疼痛有關(guān)[17]。也有研究認(rèn)為5-氧代二十二碳烯酸(5-oxoETE)通過(guò)激活腸道MrgprD引起腸預(yù)激綜合征(IBS)誘導(dǎo)的疼痛[18]。局部給予5-氧代二十二碳烯酸誘導(dǎo)小鼠內(nèi)臟疼痛但不會(huì)引起組織炎癥，因此認(rèn)為5-oxoETE直接作用于DRG神經(jīng)元。據(jù)此，MrgprD是否直接和內(nèi)臟痛相關(guān)，還是通過(guò)巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞釋放炎癥因子引起疼痛尚存在爭(zhēng)議。

神經(jīng)病理性疼痛是一種難于治療嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的疼痛[19-21]。TRP通道中多個(gè)成員都和神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)[22-23]。多個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體家族也參與了神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控[24-26]。我們推測(cè)G蛋白偶聯(lián)受體MrgprD可能也參與了神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生。為了證實(shí)我們的假設(shè)，在野生型(WT)小鼠和MrgprD敲除小鼠造坐骨神經(jīng)慢性壓迫(CCI)模型，比較2種小鼠機(jī)械痛覺(jué)、熱痛覺(jué)過(guò)敏以及冷痛覺(jué)過(guò)敏的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)未造模組小鼠3種疼痛感覺(jué)都無(wú)差異，而神經(jīng)病理性疼痛組小鼠機(jī)械痛和冷痛卻有明顯差異[7]。通過(guò)qPCR、免疫組化和鈣成像結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛小鼠MrgprD的基因水平和蛋白水平都表達(dá)增多，功能也增強(qiáng)。研究中我們首次發(fā)現(xiàn)MrgprD和神經(jīng)病理性疼痛的冷痛產(chǎn)生有關(guān)。TRPA1是已知的和冷痛有關(guān)的通道[27-28]。我們推測(cè)MrgprD下游通路可能和TRPA1相關(guān)。結(jié)果顯示，92.99% MrgprD陽(yáng)性的神經(jīng)元表達(dá)TRPA1。鈣成像和電生理結(jié)果顯示，TRPA1阻斷劑HC-030031明顯抑制了β-丙氨酸激活MrgprD引起的鈣內(nèi)流以及內(nèi)向電流。同時(shí)TRPA1基因敲除小鼠DRG神經(jīng)元和β-丙氨酸的反應(yīng)也是明顯減少。為了進(jìn)一步證實(shí)MrgprD下游通路是TRPA1，我們?cè)贖EK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染了MrgprD和TRPA1的質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同時(shí)轉(zhuǎn)染MrgprD和TRPA1的細(xì)胞比僅轉(zhuǎn)染MrgprD細(xì)胞與β-丙氨酸的反應(yīng)明顯增多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示β-丙氨酸激活MrgprD引起TRPA1磷酸化，該磷酸化可以被PKA抑制劑抑制。通過(guò)上述結(jié)果，我們認(rèn)為MrgprD下游通過(guò)PKA-TRPA1途徑參與了神經(jīng)病理性疼痛冷痛的產(chǎn)生(圖1)。過(guò)去的研究認(rèn)為β-丙氨酸激活MrgprD引起癢覺(jué)行為[4]，我們推測(cè)MrgprD激活在神經(jīng)病理性疼痛的病理?xiàng)l件下也可能會(huì)引起痛覺(jué)行為。通過(guò)高清攝像我們發(fā)現(xiàn)β-丙氨酸激活MrgprD既產(chǎn)生了癢覺(jué)(咬足行為)又產(chǎn)生了痛覺(jué)(舔腳行為)的行為，但是在神經(jīng)病理性痛模型中，小鼠足底注射β-丙氨酸引起疼痛為主的舔腳行為。MrgprD通過(guò)PKA-TRPA1途徑參與神經(jīng)病理性疼痛的研究為我們揭示了神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生的新機(jī)制，也為我們認(rèn)識(shí)疼痛的產(chǎn)生機(jī)理提供了新的思路，為治療相關(guān)疾病提供了新的作用靶點(diǎn)。

2.2 MrgprD參與癢覺(jué)的產(chǎn)生

小鼠體內(nèi)MrgprD陽(yáng)性神經(jīng)元代表了不表達(dá)TRPV1的C類纖維傷害感受器的主要亞群[13]。Noritaka等通過(guò)MrgprDDTA小鼠，用白喉毒素取代了MrgprD等位基因，可以選擇性的刪除MrgprD。他們通過(guò)注射組胺、氯奎等8種不同的引起瘙癢的化合物(不包含β-丙氨酸)，但是并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這8種瘙癢物質(zhì)可以通過(guò)MrgprD引起瘙癢[29]。

健身者喜歡食用β-丙氨酸使肌肉更加強(qiáng)壯，但會(huì)引起刺痛和瘙癢等不愉快的感覺(jué)。研究認(rèn)為β-丙氨酸特異性激活外周MrgprD神經(jīng)纖維引起瘙癢的行為是一種非組胺依賴的癢，這種癢覺(jué)抗組胺藥物的治療是無(wú)效的[4]。研究者給予WT小鼠和MrgprD基因敲除小鼠食用含有β-丙氨酸的糖水，發(fā)現(xiàn)WT小鼠產(chǎn)生瘙癢行為而MrgprD基因敲除小鼠沒(méi)有瘙癢行為，所以β-丙氨酸特異性作用于MrgprD引起瘙癢。

方酸二丁酯(SADBE)可以引起過(guò)敏性接觸性皮炎[30]。在SADBE小鼠瘙癢模型中，MrgprD陽(yáng)性神經(jīng)元表現(xiàn)出更多的去極化靜息膜電位和更大的動(dòng)作電位，鈉電流增加引起的MrgprD陽(yáng)性神經(jīng)元的興奮性增加，可能會(huì)導(dǎo)致接觸性過(guò)敏反應(yīng)相關(guān)的自發(fā)性瘙癢行為[31]。

MrgprD在瘙癢中的作用為我們研究神經(jīng)系統(tǒng)中如何感知、編碼和傳輸瘙癢信號(hào)提供了研究思路。同時(shí)，MrgprD參與非組胺依賴的癢也為我們治療抗組胺藥無(wú)效的癢覺(jué)提供了新的藥物靶點(diǎn)。

2.3 MrgprD在腫瘤中表達(dá)

雖然多數(shù)研究認(rèn)為MrgprD主要表達(dá)在外周感覺(jué)神經(jīng)元，也有研究發(fā)現(xiàn)MrgprD在肺腺癌、低分化鱗狀細(xì)胞癌、高分化鱗狀細(xì)胞癌以及小細(xì)胞癌中都有明顯表達(dá)。還發(fā)現(xiàn)在小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3中過(guò)表達(dá)MrgprD會(huì)引起腫瘤形成[5]。在非小細(xì)胞肺癌中，腫瘤組織MrgprD的表達(dá)明顯高于周圍正常組織[32]。MrgprD在肺癌的形成中可能起著重要作用，可能成為非小細(xì)胞肺癌的標(biāo)記物，也可能成為治療非小細(xì)胞肺癌的分子靶點(diǎn)。目前為止尚未發(fā)現(xiàn)其他腫瘤組織中有MrgprD的表達(dá)。MrgprD如何參與了腫瘤的形成以及是否其他腫瘤的形成有關(guān)，有待我們進(jìn)一步的研究。

2.4 MrgprD在血管中表達(dá)

腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)在調(diào)節(jié)血壓及心血管疾病發(fā)生中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MrgprD可以參與血管緊張素Ⅲ(Ang Ⅲ)的激活引起花生四烯酸的釋放[33]。Alamandine是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-2催化產(chǎn)生的新的7肽，可以激活MrgprD誘導(dǎo)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)生成增多使血管舒張[34-35]。Habiyakare等發(fā)現(xiàn)兔的主動(dòng)脈MrgprD與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)共表達(dá)，在正常家兔Alamandine與MrgprD結(jié)合增強(qiáng)乙酰膽堿引起的胸主動(dòng)脈和髂動(dòng)脈血管舒張功能，但是在動(dòng)脈粥樣硬化的家兔主動(dòng)脈卻沒(méi)有這種功能，同樣說(shuō)明MrgprD參與了血管的舒張[36]。血管緊張素Ⅱ型受體(AT2R)和MAS受體是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的重要保護(hù)組件。Villela等在實(shí)驗(yàn)中使用內(nèi)源性代謝產(chǎn)物Alamandine觀察到與其受體MrgprD的作用[37]。研究者又發(fā)現(xiàn)MrgprD下游通道通過(guò)CAMP-PKA途徑發(fā)揮作用[6]。Alamandine和MrgprD級(jí)聯(lián)作用的研究為我們認(rèn)識(shí)心血管疾病提供了一個(gè)重要線索[38]，為心血管疾病治療提供了新的藥物作用靶點(diǎn)。

3 MrgprD與中醫(yī)藥止癢鎮(zhèn)痛

中醫(yī)藥在止癢、鎮(zhèn)痛等方面效果明確，副作用小。研究認(rèn)為川芎(Lamiophlomis rotata)通過(guò)激活脊髓胰高血糖素樣肽-1受體有鎮(zhèn)痛作用[39]。雷公藤內(nèi)酯醇通過(guò)大麻素受體-2抑制神經(jīng)病理性疼痛以及骨癌痛[40]。這些中藥成分都是作用G蛋白偶聯(lián)受體起鎮(zhèn)痛作用。但是中醫(yī)藥成分復(fù)雜，多數(shù)中藥止癢、鎮(zhèn)痛的分子生物學(xué)機(jī)制目前都不清楚。本文中我們將探討的MrgprD就是一種表達(dá)于外周，和感覺(jué)產(chǎn)生相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體。

我們過(guò)去的研究認(rèn)為，乳香、末藥在治療神經(jīng)病理性疼痛方面通過(guò)作用于瞬時(shí)感受器電位離子通道(TRP)來(lái)減輕機(jī)械疼痛和熱痛。中藥藥對(duì)乳香、末藥通過(guò)抑制TRPV1的表達(dá)及功能而鎮(zhèn)痛[41]。中藥的作用經(jīng)常是多靶點(diǎn)的，可能通過(guò)多個(gè)不同的通道或受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛或止癢作用。許多中醫(yī)藥鎮(zhèn)痛、止癢的分子生物學(xué)機(jī)制目前并不清楚，我們初步試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為有些中藥單體成分可能通過(guò)作用于MrgprD起鎮(zhèn)痛作用。通過(guò)這些通道或受體，我們還可以篩選效果較好的鎮(zhèn)痛、止癢的中藥單體成分，為中醫(yī)藥的推廣和利用鋪平道路。

4 展望

自2001年被發(fā)現(xiàn)，MrgprD功能的研究越來(lái)越受到關(guān)注。作為G蛋白偶聯(lián)受體的一名成員，參與痛覺(jué)、癢覺(jué)的產(chǎn)生，同時(shí)又和腫瘤的形成、血管的舒張有關(guān)(圖1)。癢覺(jué)及痛覺(jué)信號(hào)可以激活MrgprD通過(guò)PKA-TRPA1途徑傳入中樞最終引起痛覺(jué)或癢覺(jué)的產(chǎn)生；Alamandine通過(guò)MrgprD介導(dǎo)血管的舒張；MrgprD參與了腫瘤的形成。MrgprD在痛覺(jué)和癢覺(jué)中的作用已經(jīng)得到證實(shí)，但是其調(diào)節(jié)痛、癢的分子生物學(xué)機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。MrgprD調(diào)節(jié)痛、癢的研究為治療痛、癢相關(guān)疾病提供了藥物作用的靶點(diǎn)，為開發(fā)新的止痛和止癢藥物提供了新的思路。雖然目前認(rèn)為β-丙氨酸是MrgprD特異性激動(dòng)劑，但是只激活MrgprD陽(yáng)性神經(jīng)元的50%。我們并不清楚其他50%MrgprD陽(yáng)性神經(jīng)元功能是什么，也沒(méi)有找到能夠激活絕大多數(shù)MrgprD陽(yáng)性神經(jīng)元的特異性激動(dòng)劑。另外，有研究認(rèn)為MrgprD和血管的舒張有關(guān)，并且下游通過(guò)Camp-PKA途徑參與了血管的舒張，但是否還有其他內(nèi)源性物質(zhì)可以激活MrgprD以及如何通過(guò)MrgprD和血管舒張有關(guān)，以及以后如何開發(fā)相關(guān)藥物，治療心血管疾病仍需很長(zhǎng)的路要走。也有研究認(rèn)為MrgprD參與了腫瘤的形成，但是MrgprD是如何參與腫瘤的產(chǎn)生的，以及具體的機(jī)制并不清楚。這些腫瘤相關(guān)的研究使MrgprD可能成為抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)。MrgprD作用機(jī)制的研究為痛、癢的產(chǎn)生機(jī)制，腫瘤的發(fā)生，血管的舒張?zhí)峁┝酥匾乃悸泛途€索，為藥物的研發(fā)提供了新的作用靶點(diǎn)。隨著我們對(duì)這種G蛋白偶聯(lián)受體研究的深入，MrgprD作用的分子生物學(xué)機(jī)制將逐漸被我們認(rèn)識(shí)。

此外，中醫(yī)藥在止癢、鎮(zhèn)痛方面效果明確、副作用小，但是其分子生物學(xué)機(jī)制并不清楚。目前的研究中我們以MrgprD為靶點(diǎn)，探索中醫(yī)藥止癢、鎮(zhèn)痛的分子生物學(xué)機(jī)制，同時(shí)還可以篩選中藥的止癢、鎮(zhèn)痛或抗腫瘤的成分，期望能為中醫(yī)藥的推廣和傳播做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。