面向中藥精制過程的中藥水提液淀粉含量測定方法的改進與比較

彭靜，朱華旭,李博，茅向軍

(1.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州 貴陽 550025；2.南京中醫(yī)藥大學,江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023;3.貴州省食品藥品檢驗所，貴州 貴陽 550004)

淀粉是植物中糖類的主要貯存形式，包括直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種類型[1-3]。中藥水提液中的化學成分非常復雜，現(xiàn)代研究表明，中藥水提液中的小分子藥效物質(如梔子苷、巴馬汀、黃芩苷等)是中藥藥效物質基礎的主體[4]；而淀粉、果膠等普遍存在的共性高分子物質幾乎沒有藥理活性，并導致服用劑量較大、難以轉化為新劑型等問題[5]。淀粉作為中藥水提液中典型存在的非藥效成分，應去除以減少中藥制劑的劑量。僅使用總固體含量這一指標相對籠統(tǒng)，應對中藥水提液中淀粉含量予以標定，從而反映制劑工藝的優(yōu)劣。

目前淀粉的含量測定的主要方法有碘顯色法[6-7]、酸水解法[8-9]、酶水解法[9-10]、蒽酮比色法[11-12]、AOAC官方淀粉測定法[13-14]、AACC法[15-16]等，2015年版《中國藥典》四部共收載可溶性淀粉、小麥淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉等5種淀粉，但未規(guī)定其含量測定方法，也未見中藥水提液中淀粉的含量測定方法[17]。為使中藥水提液的精制過程有著更科學的表征手段，中藥科研工作者應針對中藥水提液的特點，建立快速、準確的淀粉含量測定方法。

在預實驗篩選時發(fā)現(xiàn)：近年來出現(xiàn)的淀粉含量檢測試劑盒(試劑盒法)原方法測定結果低于實際值，原因可能是：該試劑盒最初應用于植物或食品(固態(tài))中淀粉含量的測定，由于中藥水提液成分復雜，在中藥水提液中淀粉含量測定時，提取分離不完全。

針對上述問題，本研究首先對試劑盒法針對中藥水提液的特殊性進行優(yōu)化，接著分別采用文獻報道較多的碘顯色法、酶水解法、優(yōu)化后的試劑盒法3種方法測定中藥水提液中淀粉含量。為獲得精確數(shù)據(jù)，采用配置模擬溶液的方法[18]，并將測定結果進行比較，以期獲得測定中藥水提液中淀粉含量簡單可靠的方法，為淀粉含量的分析方法提供依據(jù)。

1 材料

數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-2型，常州國華電器有限公司)；高速臺式離心機(TGL-18C-C，上海安亭科學儀器廠)；超純水器(南京易普易達有限公司)；紫外可見分光光度計(TU-1810，北京普析通用儀器有限責任公司)；電子天平(TD10002C，天津天馬衡基儀器有限公司)；電子分析天平(AUY 120，日本島津公司)；所用玻璃儀器均購自南京晚晴玻璃儀器有限公司。

可溶性淀粉標準品(批號：140602-200814)，購自中國藥品生物制品檢驗所；鹽酸小檗堿(純度98%，批號：20160228)(下文簡稱小檗堿)，梔子苷(純度95%，批號：FY1838Y1102)，綠原酸(純度98%，批號：FY1435S1130)，以上試劑均購自南通飛宇生物科技有限公司；制附子(批號：190750311)，炙甘草(批號：190701911)，干姜(批號：19062741)，麥冬(批號：190604121)，以上藥材均購自康美藥業(yè)股份有限公司；天冬(批號：190626)，購自亳州市永剛飲片廠有限公司；連翹(批號：20181101)，購自陜西興盛德藥業(yè)股份有限公司?？扇苄缘矸?批號：20180119，AR)，購自國藥集團化學試劑有限公司；淀粉酶(批號：S13S9I69923，AR)，碘(批號：Z08N9Y74560，GR)，碘化鉀(批號：J25J9D64151，AR)，甲基紅(批號：S11S8J43390，AR)，酒石酸鉀鈉(批號：Z17D9Y77735，AR)，硫酸銅(批號：Z16O9Y72576，AR 99%)，硫酸鐵(批號：Z08N9Y74556，AR)，以上試劑均購自上海源葉生物科技有限公司；高錳酸鉀(批號：20111220，AR)，硫酸(批號：20161026，AR)，鹽酸(批號：20160122，AR)以上試劑均購自上海凌峰化學試劑有限公司；氫氧化鈉(批號：180402088E，AR)，購自南京化學試劑股份有限公司；草酸鈉(批號：180820，PT)，購自上海展云化工有限公司；淀粉含量檢測試劑盒(批號：20181019)，購自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 淀粉模擬溶液的制備 結合本課題組前期數(shù)據(jù)，中藥水提液中淀粉含量在0.20～18.59 mg/mL,并參考文獻[18-21]的方法，分別稱取0.10、0.50、1.00、2.00 g可溶性淀粉制備得1.00、5.00、10.00、20.00 mg/mL淀粉模擬溶液。

2.1.2 小分子+淀粉模擬溶液的制備 分別制備3份4種濃度的淀粉模擬溶液，準確稱取0.113 8 g小檗堿、0.122 6 g梔子苷、0.108 5 g綠原酸分別加入4種濃度淀粉模擬溶液中，超聲使其完全溶解即可分別得0.000 3 mol/L上述小分子物質+淀粉模擬溶液。

2.1.3 連翹水提液的制備 稱取連翹100.00 g,煎煮2次,每次1 h,第1次加水10倍量,第2次加水8倍量,4層紗布過濾,濾液合并,冷卻后即得連翹水提液。

2.1.4 二冬膏復方水提液的制備 稱取麥冬、天冬各50.00 g，制備方法同2.1.3。

2.1.5 四逆湯復方水提液的制備 稱取制附子75.00 g,干姜30.00 g,炙甘草30.00 g，制附子先煎，煎煮1 h后加入干姜、炙甘草，制備方法同2.1.3。

2.2 碘顯色法

采用碘顯色法測定不同體系模擬溶液淀粉含量。以吸收度(A)為縱坐標，可溶性淀粉濃度C(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程為A=5.244 7C-0.006 1,R2=0.999 5。表明可溶性淀粉在0.010 0～0.100 0 mg/mL之間吸光度呈良好的線性關系。依照文獻方法進行試驗，符合方法學要求[20-21]。

2.3 酶水解法

參照文獻[19,22]的方法，采用酶水解法測定不同體系模擬溶液淀粉含量。樣品在淀粉酶的作用下，使淀粉水解為低分子糊精和麥芽糖，再用鹽酸進一步水解為葡萄糖，然后按還原糖測定法測定其含量，并折算成淀粉含量。

淀粉含量計算：

m1=0.438 8x-0.480 5；

其中m1為氧化亞銅相當于葡萄糖質量(mg)；x為上式計算出的氧化亞銅的質量；m為樣品溶液的取樣量。依照文獻方法進行試驗，符合方法學要求。

2.4 淀粉含量檢測試劑盒法

2.4.1 原理 利用80%乙醇將樣品中可溶性糖與淀粉分離，進一步采用酸水解法將淀粉分解為葡萄糖。采用比色法測定葡萄糖含量，計算淀粉含量。

2.4.2 優(yōu)化后的試劑盒法操作步驟

2.4.2.1 標準溶液的制備 將10.00 mg/mL葡萄糖標準液進行逐級稀釋得到0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.003 125、0.001 56 mg/mL標準液備用。

2.4.2.2 測定步驟 準確移取0.20 mL樣品，加入2.00 mL試劑1(為80%乙醇，下文同),80 ℃提取2 h后，3 000×g常溫離心10 min，棄去上清液，沉淀中加入0.50 mL雙蒸水，放入沸水中糊化15 min。待冷卻后加入0.35 mL試劑2，常溫提取15 min，振蕩3～5次。加入0.85 mL雙蒸水，混勻，3 000×g常溫離心10 min，取上清液100 μL加入700 μL蒸餾水稀釋。

葡萄糖標準品的測定：取0.20 mL標準溶液(蒸餾水做空白)和1.00 mL工作液至EP管中，95 ℃水浴10 min，冷卻至室溫，620 nm波長下測定吸光度值。以吸收度(A)為縱坐標，葡萄糖標準液濃度C(mg/mL)為橫坐標，得回歸方程為A=0.351 5C+0.009 5，R2=0.999 2，表明樣品轉化為葡萄糖含量在0.001 56～0.200 00 mg/mL之間吸光度呈良好的線性關系。

樣品測定同標準品測定。

2.4.2.3 淀粉含量的計算

其中V提取為提取后體積；W為取樣量。

3 結果

3.1 淀粉測定方法的優(yōu)化

結果見表1～2。

表1 提取時間對10.00 mg/mL淀粉模擬溶液中淀粉含量測定的影響

表2 試劑1對淀粉含量測定的影響

參照表1～2的結果，對其測定方法進行了如下優(yōu)化：為使淀粉充分分離，試劑1的量由1.00 mL增加為2.00 mL；80 ℃提取時間由原來的30 min更改為2 h；冷卻后離心時間由5 min延長為10 min，以保證析出的沉淀能夠完全離心。上述優(yōu)化后的方法可將淀粉有效分離，為保證測定結果更接近真值，故進行以上改動。

在實際中藥水提液中，淀粉含量是未知的，其溶液是一種熱力學不穩(wěn)定體系，在放置時可隨其他物質沉淀。考慮到部分水提液淀粉含量較低等問題，為測量準確，建議選取濃度梯度，即將“2.4.2.2”中分別準確移取0.20、0.40、0.60 mL樣品，評估淀粉含量，根據(jù)結果選擇適當操作以獲得更接近真值的中藥水提液淀粉的測定結果。本實驗選取3種中藥水提液進行測試，依照中藥提取液中淀粉含量分布，一般情況下取樣量0.20 mL即可滿足測定需求，若淀粉含量較低取樣量0.40 mL可滿足含量測定需求，其結果如表3所示。由于本方法為試劑盒操作，每次樣品需求量較少，并可平行測試，并不會使得測試環(huán)節(jié)復雜。為進一步證明該方法的可行性，因此進行方法學考察。

表3 樣品體積對中藥水提液中淀粉含量測定的影響

3.2 優(yōu)化后的試劑盒法的方法學考察

3.2.1 精密度考察 依照“2.1.1”項下方法制備6份10.00 mg/mL淀粉標準品溶液，依照“2.4.2”項下方法，平行測定6次，結果見表4。測得淀粉的RSD值為1.91%，表明此方法精密度良好。

表4 精密度實驗考察結果(n=6)

3.2.2 重復性考察 按“2.1”項方法制備10.00 mg/mL淀粉溶液、小檗堿+10.00 mg/mL淀粉溶液、梔子苷+10.00 mg/mL淀粉溶液、綠原酸+10.00 mg/mL淀粉溶液、連翹水提液、二冬膏水提液、四逆湯水提液各6份，按“2.4.2”項方法，平行測定6次，結果見表5。

表5 重現(xiàn)性實驗考察結果(n=6)

3.2.3 加樣回收率 按“2.1”項方法制10.00 mg/mL淀粉溶液、小檗堿+10.00 mg/mL淀粉溶液、梔子苷+10.00 mg/mL淀粉溶液、綠原酸+10.00 mg/mL淀粉溶液、連翹水提液、二冬膏水提液、四逆湯水提液各6份，按“2.1.1”項方法制備10.00 mg/mL淀粉標準品溶液6份，精密吸取適量供試品溶液于EP管中，并加入0.50 mL淀粉標準品溶液，按“2.4.2”項方法，平行測定6次，結果見表6。

表6 加樣回收率測定結果(n=9)

由于淀粉是共性高分子物質，其分散在水中形成懸浮液水溶膠，是一種典型的熱力學不穩(wěn)定體系，故未對其進行穩(wěn)定性考察。由精密度相對標準偏差RSD(n=6)為1.91%，淀粉溶液、小檗堿+淀粉溶液、梔子苷+淀粉溶液、綠原酸+淀粉溶液(淀粉濃度均為10 mg/mL)，連翹、二冬膏、四逆湯水提液的重復性RSD(n=6)值為1.82%～4.32%，表明該方法重現(xiàn)性良好，測試結果穩(wěn)定，平均加樣回收率在99.18%～104.41%，RSD(n=9)為2.33%～4.94%。結果表明優(yōu)化后的淀粉測定方法具有較好的精密度及準確度，可作為中藥水提液中淀粉含量測定的檢測方法。

3.3 模擬溶液的淀粉含量測定方法比較

3.3.1 單淀粉模擬溶液淀粉含量測定結果 結果見表7。

表7 不同濃度淀粉模擬溶液含量測定結果

從表7中3種方法測定淀粉含量的結果可知，在碘顯色法中由于淀粉標準品和淀粉試劑存在差異，雖然方法學表現(xiàn)出良好的線性，各濃度結果仍與實際值差異較大；試劑盒原方法測定結果偏低可能是在提取過程中試劑1的量不足以及提取時間較短導致淀粉并未完全分離；而酶水解、優(yōu)化后的試劑盒法結果更為接近真值。但中藥水提液中，是小分子藥效物質與淀粉共存的狀態(tài)，因而需觀察小分子藥效物質的存在對淀粉含量測定結果的影響，經(jīng)考慮，選擇3種具有代表性的小分子藥效物質，分別為：代表生物堿類物質的鹽酸小檗堿、代表環(huán)烯醚萜苷類物質的梔子苷、代表有機酸類物質的綠原酸，與淀粉模擬溶液混合，進行后續(xù)實驗。

3.3.2 小分子藥效物質對淀粉含量測定結果的影響 結果見表8。

表8 0.000 3 mol/L小分子藥效物質淀粉模擬溶液含量測定結果

由表8可知，由于小分子藥效物質對于吸光度的影響，碘顯色法測定結果偏差較大，提示碘顯色法并不適用于中藥水提液模擬溶液體系，由于淀粉是α-葡萄糖分子縮合而成螺旋體有羥基暴露在螺旋外，碘分子與羥基作用嵌入軸心部位形成包合物。小分子藥效物質結構中有羥基存在可能與碘作用從而影響實驗結果，同時由于模擬溶液顏色發(fā)生改變，即使在空白中加入相同摩爾質量的小分子藥效物質也會影響吸光度值A。

而酶水解法在苷類物質存在的情況下會影響其測定結果，同時考慮到酶水解法操作復雜，需要樣品量較多，耗時較長(一次測定需要至少6 h的時間)。酶水解法中，淀粉酶的水解具有一定的專一性不會水解其他多糖，但當梔子苷水溶液中加入稀酸，可能引起苷鍵水解而形成糖分子[23-27]，從而影響測定結果，故而梔子苷+淀粉模擬溶液實驗結果偏高，提示有可能苷類物質存在會影響酶水解法的測定結果；而鹽酸小檗堿、綠原酸的加入并未影響淀粉含量的測定，結果也接近真值。

表7～8結果表明優(yōu)化后的試劑盒法測定結果更為接近真值，由于此方法先通過加入80%乙醇從而破壞樣品中的淀粉-水分子的氫鍵，降低淀粉在水中的溶解度，使之以沉淀的形式析出，因而避免了中藥水提液中小分子藥效物質的影響。國外標準[13,15]中采用總淀粉檢測試劑盒進行淀粉含量測定。本課題組借鑒AOAC、AACC協(xié)會標準，綜合準確性和時效性等因素考慮，初步確定經(jīng)本團隊優(yōu)化后的試劑盒測定方法較適用于中藥水提液中淀粉含量的測定。

4 討論

中藥(含復方)由植物、動物和礦物等天然產(chǎn)物構成，不可避免的需要“去偽存真，去粗取精”，因而“分離”是中醫(yī)藥領域的共性關鍵技術。若不進行精制與分離，中藥提取液難以與現(xiàn)代劑型接軌，在其精制過程中，僅使用固含量的變化作為依據(jù)有些不夠準確，在《中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略規(guī)劃綱要(2016-2030年)》《中共中央國務院關于促進中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新發(fā)展的意見》[28]的指導下，科研工作者更需要了解中藥精制過程中去除了什么，去除了多少，因而，淀粉作為中藥水提液中無藥理活性、需要去除的物質之一，迫切需要一種較為簡單、準確的含量測定方法。

前期科研工作者研究[19,22,29]中發(fā)現(xiàn)中藥水提液中淀粉含量在0.20～18.59 mg/mL。本實驗選取可基本覆蓋中藥水提液淀粉分布的4種濃度的淀粉模擬溶液為測試體系，研究含量測定的方法。中藥水提液中藥效成分組成復雜，常含有苷類、黃酮類、生物堿類等成分[30]，本團隊經(jīng)過調(diào)研，選擇結構穩(wěn)定、分布廣泛、藥理活性確切的生物堿類的小檗堿、環(huán)烯醚萜苷類的梔子苷、有機酸類的綠原酸3種小分子藥效物質以探索小分子藥效物質對淀粉含量測定結果的影響，具有一定的代表性。所選用的單方水提液、復方水提液均為臨床常用方劑，確認了優(yōu)化后方法的合理可行。

本實驗面向中藥精制過程，結合中藥水提液的復雜性和特殊性對試劑盒法進行優(yōu)化，通過配置含有小分子藥效物質的模擬溶液對比3種淀粉含量檢測方法，經(jīng)試驗，確定優(yōu)化后的試劑盒法準確性高、重現(xiàn)性好，適用于中藥水提液體系，可為中藥水提液中淀粉含量測定提供參考依據(jù)。