左歸降糖舒心方含藥血漿對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞泡沫化和凋亡的影響

楊金偉,趙燦，劉秀，吳勇軍，喻嶸,

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一中醫(yī)臨床學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.中醫(yī)方證研究轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病主要的大血管并發(fā)癥之一，其主要的病理改變是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，而巨噬細(xì)胞泡沫化和凋亡是導(dǎo)致斑塊形成的重要因素，加速動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病的進(jìn)展的主要原因[1]。機(jī)體長(zhǎng)期糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗及慢性炎性反應(yīng)激活巨噬細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(ERS)[2]。過度的ERS可激活C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(CHOP)和半胱氨酸蛋白酶蛋白-12(Caspase-12)等信號(hào)途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步刺激粥樣斑塊的形成[3]。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞ERS過程中，PERK/eIF2α/ATF4信號(hào)可能參與了巨噬細(xì)胞不可逆損傷及功能降低，對(duì)泡沫化及凋亡進(jìn)程具有關(guān)鍵調(diào)控作用[4]。以滋陰益氣、活血解毒立法組成左歸降糖舒心方(由黃芪、生地、丹參、山茱萸等9味藥組成)為基礎(chǔ)方左歸復(fù)方的增減方，具有改善糖脂代謝和減少炎癥因子對(duì)細(xì)胞損傷的作用，減緩糖尿病并發(fā)血管病變的風(fēng)險(xiǎn)，其作用機(jī)制與減輕炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷相關(guān)[5-6]。本研究利用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞J774A.1泡沫化及ERS，進(jìn)一步探索左歸降糖舒心方含藥血漿對(duì)ERS關(guān)鍵信號(hào)通路PERK/eIF2α/ATF4和ERS凋亡相關(guān)蛋白CHOP、Caspase-12表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞株

8周齡SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0006。于湖南中醫(yī)藥大學(xué)東塘校區(qū)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。放置于溫度(22±2)℃及濕度50%～65%恒定的環(huán)境中。自由飲食，自由飲水，光/暗周期為12 h/12 h(光照時(shí)間為6:00-18:00)；小鼠J774A.1巨噬細(xì)胞購(gòu)自于湖南豐暉生物科技有限公司。

1.2 藥物

左歸降糖舒心方由黃芪、生地、丹參、山茱萸等9味藥物構(gòu)成，所有藥材均購(gòu)自于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診中藥房，以5倍藥材量的單蒸水浸泡1 h，煮沸后以小火煎煮30 min，過濾后取汁；藥渣再加3倍量的單蒸水煎煮20 min，過濾取汁。2次藥汁混合，在恒溫水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮制備成含生藥質(zhì)量濃度為2 g/mL的藥液，經(jīng)滅菌后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。二甲雙胍片：規(guī)格0.25 g×12片，浙江亞太藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：17061412；阿托伐他汀鈣片：規(guī)格20 mg×7片，北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：190607；?；切苋パ跄懰?TUDCA)：上海源葉生物有限公司，批號(hào)：T29M7T12089。

1.3 試劑與儀器

胎牛血清，美國(guó)GIBCO公司；胰蛋白酶-EDTA消化液，北京Solarbio公司；DMSO，美國(guó)Amresco公司；CCK-8，日本同仁公司；ox-LDL，廣州奕源生物有限公司；牛血清白蛋白，瑞士Roche公司；Alexa Fluor?488標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗，中杉金橋生物技術(shù)有限公司；p-PERK、p-eIF2α、ATF4及Caspase-12、CHOP多克隆抗體，Abcam公司。SW-CJ-2G超凈工作臺(tái)，美國(guó)Thermo公司；冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；Milli-Q Advantage純水裝置，美國(guó)Milipore公司；ELx800酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；AE 31型倒置顯微鏡，廈門Motic公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠J774A.1巨噬細(xì)胞以含10%胎牛血清，90%DMEM的完全培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、25 mmol/L葡萄糖)在37 ℃、5%CO2,培養(yǎng)箱中分化。2～3 d更換1次培養(yǎng)液，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞體積明顯增大，向四周伸出足突，分化成熟的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 含藥血漿的制備

將30只SD大鼠按照隨機(jī)原則分成3組：空白血漿組、左歸降糖舒心方組、西藥聯(lián)合(二甲雙胍聯(lián)合阿托伐他汀鈣)組，每組10只。按照臨床70 kg成人劑量的5倍給藥，左歸降糖舒心方組藥物濃度為2 g/mL，灌胃量為22.5 mL/(kg·d)；二甲雙胍灌胃劑量為0.45 g/(kg·d)，阿托伐他汀鈣灌胃劑量為1.8 mg/(kg·d)；空白血漿組采用等劑量的滅菌超純水灌胃。連續(xù)灌胃5 d，對(duì)于每天灌胃總量超4 mL的組分2次給藥，取血前12 h予以撤食不撤水，末次灌胃1 h后，予以麻醉，腹主動(dòng)脈取血，用含EDTA抗凝管收集血液，3 000 r/min離心15 min，用吸管取上層血漿，0.22 μm濾膜過濾，56 ℃恒溫水浴鍋滅活30 min，將滅活的血漿分裝至無菌EP管中，置于-80 ℃保存。

2.3 CCK-8檢測(cè)J774A.1巨噬細(xì)胞增殖抑制率

取處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的J774A.1細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入10%FBS DMEM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，用10%FBS DMEM完全培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)成5×104mL-1，加至96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，放入37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用預(yù)冷的培養(yǎng)液將細(xì)胞同步化處理后，分別加入25、50、100、150、200 mg/L的ox-LDL或10%含藥血漿干預(yù)培養(yǎng)J774A.1細(xì)胞24 h，以10%FBS DMEM培養(yǎng)的細(xì)胞為正常對(duì)照組，每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。待分別干預(yù)處理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，1.5 h后用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光值(OD值)，計(jì)算：抑制率=(對(duì)照孔吸光值-實(shí)驗(yàn)孔吸光值)/對(duì)照孔吸光值×100%，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，共檢測(cè)3次，取平均值。

2.4 分組處理

將分化好的J774A.1細(xì)胞用10%FBS DMEM培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度為5×104mL-1的懸液，使用完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%左右予以100 mg/L ox-LDL干預(yù)處理，24 h后收集細(xì)胞，隨機(jī)分成正常組(10%FBS DMEM完全培養(yǎng)液)、模型組(100 mg/L ox-LDL+10%空白血漿)、TUDCA組(500 mg/L TUDCA+100 mg/L ox-LDL+10%空白血漿)、左歸降糖舒心方含藥血漿組(100 mg/L ox-LDL+10%左歸降糖舒心方含藥血漿)、西藥聯(lián)合含藥血漿組(100 mg/L ox-LDL+10%西藥聯(lián)合含藥血漿)。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞處理結(jié)束后，胰酶消化細(xì)胞，用無菌PBS清洗1次，將細(xì)胞重懸300 μL結(jié)合緩沖液，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶(PI)染色液混勻，常溫避光孵育20 min。另以正常組設(shè)未染色管、只加Annexin V-FITC管、只加PI管用于調(diào)試及對(duì)照，于流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析檢測(cè)。以未染色細(xì)胞調(diào)零，以Annexin V-FITC單染管和PI單染管作為基準(zhǔn)對(duì)照，測(cè)定細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 Western blot法檢測(cè)p-PERK、p-eIF2α、ATF4及Caspase-12、CHOP蛋白表達(dá)

分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的J774A.1細(xì)胞,以每孔5×105個(gè)接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后加入不同的藥物干預(yù)，正常組不加藥；細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)上清液，用PBS洗滌2次，按1∶10的體積比例加入含PMSF的蛋白裂解液，低溫下勻漿后將樣品轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液即為所提取的總蛋白。采用BCA法將蛋白定量后，行SDS-PAVE(分離膠濃度為1 000)分離蛋白。隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的封閉液室溫封閉，加入兔抗人p-PERK、p-eIF2α、ATF4及Caspase-12、CHOP抗體4 ℃孵育過夜，TEST洗滌3次，用化學(xué)發(fā)光法顯影、沖洗膠片。采用Images-Pro Plus 6.0灰度掃描軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 ox-LDL對(duì)J774A.1細(xì)胞增殖的影響

如表1所示，與正常組比較，J774A.1細(xì)胞在不同濃度的ox-LDL干預(yù)下，均存在細(xì)胞增殖抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且伴隨著藥物濃度的增加，J774A.1的增殖抑制率呈濃度依賴性改變，其中100 mg/L ox-LDL干預(yù)24 h的抑制率為(50.06±0.09)%，故考慮以100 mg/L ox-LDL干預(yù)24 h為最佳造模方法。

表1 各組J774A.1細(xì)胞增殖情況比較

注：與正常組相比，**P<0.01。

3.2 左歸降糖舒心方含藥血漿對(duì)J774A.1細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響

油紅O染色顯示，在ox-LDL誘導(dǎo)下，細(xì)胞內(nèi)脂滴聚集增多，存在濃度依賴性變化，以100 mg/L ox-LDL組增加最為明顯(P<0.01)；而濃度在100 mg/L與150 mg/L無明顯差異(P>0.05)。正常組油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞少或無；各藥物干預(yù)組平均IOD值與100 mg/L ox-LDL組相比顯著下降(P<0.01)，表明左歸降糖舒心方含藥血漿可顯著降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積；藥物干預(yù)組間比較，左歸降糖舒心方含藥血漿組優(yōu)于西藥聯(lián)合含藥血漿組，與TUDCA組相比無明顯差異。見圖1。

3.3 左歸降糖舒心方含藥血漿對(duì)J774A.1細(xì)胞凋亡率比較

如表2所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，各藥物干預(yù)組J774A.1細(xì)胞凋亡率均明顯降低(P<0.01)；與西藥聯(lián)合含藥血漿組比較，TUDCA組和左歸降糖舒心方含藥血漿組J774A.1細(xì)胞凋亡率降低較明顯(P<0.01)，而左歸降糖舒心方含藥血漿組與TUDCA組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較

注：與正常組相比，**P<0.01；與模型組相比，##P<0.05；與西藥聯(lián)合含藥血漿組相比，△△P<0.01。

3.4 左歸降糖舒心方含藥血漿對(duì)J774A.1細(xì)胞PERK/eIF2α/ATF4通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖2所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，各藥物干預(yù)組p-PERK、p-eIF2α、ATF4蛋白表達(dá)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與西藥聯(lián)合含藥血漿組比較，TUDCA組和左歸降糖舒心方含藥血漿組蛋白表達(dá)降低較明顯；左歸降糖舒心方含藥血漿組與TUDCA組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.5 左歸降糖舒心方含藥血漿對(duì)J774A.1細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞Caspase-12、CHOP蛋白表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比較，左歸降糖舒心方含藥血漿組、西藥聯(lián)合含藥血漿組、TUDCA組細(xì)胞Caspase-12、CHOP蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.01)，但各藥物干預(yù)組仍高于正常組(P<0.01)；與西藥聯(lián)合含藥血漿組細(xì)胞對(duì)比，左歸降糖舒心方含藥血漿組與TUDCA組細(xì)胞蛋白表達(dá)更低(P<0.01)，且左歸降糖舒心方含藥血漿組與TUDCA組具有相同的作用效應(yīng)(P>0.05)。

4 討論

糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病的主要心血管并發(fā)癥之一，是2型糖尿病(T2DM)患者致死和致殘的主要原因[7]。其早期癥狀隱匿，中后期因粥樣斑塊的形成，引起管腔狹窄，易致糖尿病患者心血管終末事件高發(fā)[8]。巨噬細(xì)胞的泡沫化及凋亡是糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要病理改變[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成、折疊、運(yùn)輸以及儲(chǔ)存鈣的主要場(chǎng)所，與脂質(zhì)合成代謝平衡密切相關(guān)，對(duì)各種刺激極為敏感[10]。在糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化過程中，糖脂代謝失常、氧化應(yīng)激及鈣離子失衡等因素，引起錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及細(xì)胞內(nèi)鈣平衡紊亂的狀態(tài)。機(jī)體代償過程中，可激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[11]。而過度或持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài)使機(jī)體進(jìn)入失代償期，激活ERS反應(yīng)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換及膽固醇堆積，相關(guān)凋亡信號(hào)通路的上調(diào)促使細(xì)胞凋亡。近年臨床與實(shí)驗(yàn)研究表明ERS在糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的病理進(jìn)程中起重要作用，抑制ERS的過度激活成為其潛在的治療方法[12-13]。

ERS反應(yīng)中，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白PERK執(zhí)行感知和介導(dǎo)反應(yīng)的功能[14]。在未折疊/錯(cuò)誤蛋白蓄積超過UPR的代謝閾值時(shí)，PERK與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)域解離，在磷酸化過程中轉(zhuǎn)化為具有活性作用的p-PERK，進(jìn)而磷酸化eIF2α，一方面可下調(diào)細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤蛋白整體翻譯水平，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷，從而維持細(xì)胞生存；另一方面，當(dāng)ERS進(jìn)一步加劇時(shí)，eIF2α也可特異性活化ATF4表達(dá)，激活細(xì)胞自噬、抗氧化及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等過程，維持穩(wěn)態(tài)[15-16]。隨著應(yīng)激反應(yīng)的持續(xù)，ATF4進(jìn)入ERS相關(guān)凋亡程序，可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白CHOP和Caspase-12表達(dá)增強(qiáng)。CHOP是特異性的轉(zhuǎn)錄因子，過量的表達(dá)可促其轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)；同時(shí)激活三磷酸肌醇受體(IP3R)，促進(jìn)鈣離子釋放，進(jìn)而觸發(fā)鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶誘導(dǎo)線粒體及ROS等凋亡途徑[17]。同時(shí)，ERS過程中可特異性激活位于胞漿側(cè)的Caspase-12通路，上調(diào)Caspase-9、Caspase-3促發(fā)細(xì)胞凋亡[18]。CHOP和Caspase-12存在各自的特異凋亡途徑或共同協(xié)調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而其凋亡效應(yīng)的出現(xiàn)受上游PERK/eIF2α/ATF4信號(hào)通路的誘導(dǎo)。

在巨噬細(xì)胞泡沫化及粥樣斑塊形成的過程中，ox-LDL發(fā)揮重要作用，脂質(zhì)過氧化可生成多種高反應(yīng)性醛，造成細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積誘導(dǎo)成為泡沫細(xì)胞，血管壁局部沉積，形成粥樣斑塊。本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞存活及凋亡率，ox-LDL處理后，J774A.1細(xì)胞存活率降低，在100 mg/L的濃度下抑制率是(50.06±0.09)%，細(xì)胞凋亡率為(51.07±0.19)%；油紅O染色結(jié)果表明ox-LDL可成劑量依賴性地引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)增多，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，巨噬細(xì)胞泡沫化制備成功[19]。左歸降糖舒心方含藥血漿可干預(yù)有效降低ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，減緩細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積。同時(shí)，ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞清道夫受體表達(dá)增加，識(shí)別與吞噬效應(yīng)增強(qiáng)，過度激活ERS，參與細(xì)胞炎性反應(yīng)及凋亡過程。通過檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：較正常組，ox-LDL干預(yù)誘導(dǎo)的模型組中CHOP、Caspase-12的表達(dá)有明顯增高的趨勢(shì)，而左歸降糖舒心方含藥血漿的干預(yù)可有效降低凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。為了進(jìn)一步證實(shí)左歸降糖舒心方含藥血漿的保護(hù)機(jī)制是否與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDCA作為對(duì)照，Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，左歸降糖舒心方含藥血漿可抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路PERK/eIF2α/ATF4的激活，CHOP、Caspase-12的表達(dá)，且其作用效果與TUDCA相當(dāng)，明顯優(yōu)于西藥聯(lián)合含藥血漿組。

綜上所述，左歸降糖舒心方含藥血漿對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的J774A.1巨噬細(xì)胞泡沫化和細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用。其干預(yù)的作用機(jī)制可能是通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)PERK/eIF2α/ATF4信號(hào)通路，抑制凋亡關(guān)鍵蛋白CHOP、Caspase-12表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。左歸降糖舒心方通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是一種干預(yù)糖尿病動(dòng)粥樣硬化的新方法，可早期逆轉(zhuǎn)ox-LDL細(xì)胞內(nèi)攝入，截?cái)嘀鄻影邏K形成。同時(shí)，本研究還需進(jìn)一步開展體內(nèi)或臨床研究來探索驗(yàn)證左歸降糖舒心方對(duì)巨噬細(xì)胞保護(hù)作用及調(diào)控糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。