基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討金欣口服液治療新型冠狀病毒肺炎的潛在作用機(jī)制

何鈺，許海燕，單進(jìn)軍，趙霞，沈存思，紀(jì)建建，林麗麗，楊瑞，謝彤，汪受傳

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省兒童呼吸疾病(中醫(yī)藥)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.南通市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科，江蘇 南通 226007)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)感染誘發(fā)的肺炎(COVID-19)引發(fā)嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生事件。截至北京時間2020年4月2日13:00，全球NCP累積確診病例937 567例，死亡47 256例，涉及180個國家和地區(qū)[1]。

中國成功遏制了疫情蔓延，取得階段性成果，為國際社會提供重要借鑒，其中中醫(yī)藥發(fā)揮的力量不可小覷，特別是阻止病情繼續(xù)擴(kuò)大以及縮短疾病治療時程等方面方面發(fā)揮了極其獨(dú)特的積極作用。金欣口服液是在麻杏石甘湯的基礎(chǔ)上加減所得，大量研究結(jié)果顯示其治療病毒性肺炎效果顯著[2-3]。中藥方劑成分復(fù)雜，具有多靶多效特點(diǎn)[4]，注重從整體觀上對病證辨證施治。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)選取信號節(jié)點(diǎn)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計，與中醫(yī)藥多靶點(diǎn)、整體效應(yīng)相符合[5-7]。本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究金欣口服液治療COVID-19的可能性和潛在靶點(diǎn)，為金欣口服液更廣泛地應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 篩選類藥性成分及其作用靶點(diǎn)

基于中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)查詢配伍藥物麻黃(Ephedra herba)、苦杏仁(Amygdalus communis vas)、黃芩(Scutellariae radix)、葶藶子(Lepidii semen descurainiae semen)、桑白皮(Mori cortex)、前胡(Peucedani radix)和虎杖(Polygoni cuspidati rhizoma et radix)的物質(zhì)組成分，以口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%、成藥相似性(Drug likeindex,DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選合適的類藥成分。通過PubChem獲取化學(xué)結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)的SMILES信息以及InChIKeys信息。以ClassyFire化學(xué)結(jié)構(gòu)分類器(https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu)對得到的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分類。數(shù)據(jù)可視化通過sunburst R包實(shí)現(xiàn)。

1.2 疾病對應(yīng)靶點(diǎn)的收集

疾病對應(yīng)的靶點(diǎn)通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)收集。以疾病對應(yīng)的MeSH標(biāo)準(zhǔn)主題詞為關(guān)鍵詞，在數(shù)據(jù)庫中搜索疾病對應(yīng)的靶點(diǎn)。所選擇MeSH標(biāo)準(zhǔn)主題詞及其對應(yīng)的疾病ID號分別為：嚴(yán)重急性呼吸綜合征C1175175(Severe acute respiratory syndrome,SARS)、中東呼吸癥候群冠狀病毒感染癥C3694279(Middle east respiratory syndrome,MERS)、呼吸道合胞病毒C0035235(Respiratory syncytial virus infection,RSV)和肺炎C0032285(Pneumonia)。

1.3 潛在治療靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

所有的靶點(diǎn)基因和靶點(diǎn)蛋白通過Uniport(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋標(biāo)準(zhǔn)化。將金欣口服液中類藥性成分相關(guān)的靶點(diǎn)和疾病相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，篩選出具有交互性的治療靶點(diǎn)基因。將篩選得到的靶點(diǎn)基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。數(shù)據(jù)可視化通過venn R包實(shí)現(xiàn)。

1.4 基因本體分析和代謝通路分析

篩選得到的基因靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)行差異基因的基因本體功能注釋和代謝通路分析，特征地識別和分析潛在靶點(diǎn)。從結(jié)果中挖掘FDR值小于0.05，且基因本體注釋語句與肺炎直接相關(guān)的基因本體和代謝通路。構(gòu)建化合物→基因→基因本體通路的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，通過CytoScape軟件(https://cytoscape.org)實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 金欣口服液的效應(yīng)成分分析

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢到金欣口服液成方中七種中藥的物質(zhì)組成分共962種，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)得到129個類藥性成分。韋恩圖的結(jié)果表明，金欣口服液中類藥性的成分主要集中在前胡、桑白皮、麻黃以及苦杏仁中(圖1A～B)?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)分類結(jié)果表明，類藥性成分主要分布在黃酮大類和脂類成分，黃酮大類包括黃烷酮類、黃酮類以及甲基化黃酮類，脂質(zhì)類成分主要包括固醇及甾體類、異戊烯醇脂、脂肪酰類(圖1C～D)。篩選的具體結(jié)果見表1。

表1 金欣口服液物質(zhì)成分化學(xué)分類結(jié)果

2.2 金欣口服液治療新型冠狀病毒的潛在靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出類藥成分對應(yīng)的靶點(diǎn)共268個。新型冠狀病毒是一種單鏈RNA正鏈包膜β冠狀病毒，與SARS、MERS相似，基因組序列分別具有79%和50%的同源性[8]，因此選擇SARS和MERS所對應(yīng)的疾病為關(guān)鍵詞在DisGeNET搜索疾病相關(guān)靶點(diǎn)。由于金欣口服液在治療RSV肺炎方面療效顯著，因此我們將RSV肺炎也作為關(guān)鍵詞納入篩選標(biāo)準(zhǔn)。共挖掘到疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因805個。整合類藥成分相關(guān)靶點(diǎn)基因和疾病相關(guān)基因，挖掘出金欣口服液可能用于治療新型冠狀病毒肺炎的潛在靶點(diǎn)共75個(圖2)。

2.3 潛在治療靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)互作分析

75個靶點(diǎn)基因輸入數(shù)據(jù)庫，以互作得分>7.0作為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析。共得到75個節(jié)點(diǎn)和527條相互作用線，蛋白質(zhì)相互作用富集P<0.01。采用K-means聚類算法對蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果以Uniport關(guān)鍵詞和Reactome信號通路注釋條目表示(圖3，表2)。

2.4 基因本體分析和KEGG通路分析

將靶基因輸入DAVIDA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因本體分析和代謝通路分析。以富集的FDR值<0.05篩選基因本體(Gene ontology,GO)數(shù)據(jù)和KEGG代謝通路數(shù)據(jù)。共挖掘到生物過程(Biological process,BP)注釋條目45個、細(xì)胞組成(Cellular component,CC)條目12個、分子功能條目(Molecular function,MF)19個、KEGG代謝通路分析(KEGG pathway)條目66個，從中挖掘與抗病毒免疫以及炎癥應(yīng)答相關(guān)的注釋條目繪制氣泡圖(圖4)，并進(jìn)一步構(gòu)建化合物→基因→富集通路圖(圖5)。

3 討論

新型冠狀病毒肺炎在中醫(yī)理論上屬于疫病、瘟疫的范疇[9]，臨床上以清熱、解毒、化濕為主。金欣口服液在麻杏石甘湯的基礎(chǔ)上加減所得，全方宣肺開閉、清熱解毒、化痰止咳、除濕,治療病毒性肺炎有顯著療效[10]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)共篩選出金欣口服液中129種類藥性成分，包括苯丙素類83種、脂類成分27種、苯環(huán)型化合物6種、有機(jī)氧化合物7種等。報道指出天然植物中的黃酮類成分高效低毒，具有良好的體內(nèi)外抗多種病毒活性，能有效預(yù)防和治療病毒性感染[11]。

篩選到的類藥成分-疾病交互的靶點(diǎn)75個，進(jìn)行進(jìn)一步的蛋白質(zhì)互作的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析。根據(jù)相似度算法可將關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點(diǎn)聚類成不同社區(qū)(Community)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：炎癥因子相關(guān)的靶點(diǎn)聚類在同一個社區(qū)內(nèi)，如IL-1A、IL-1B、IL-10等(圖3中紅色靶點(diǎn))，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)靶點(diǎn)聚集在同一個社區(qū)內(nèi)，如MAPK和JUN等(圖3中藍(lán)色靶點(diǎn))。對蛋白質(zhì)互作靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，Uniport關(guān)鍵詞富集分析發(fā)現(xiàn)，互作主要富集在細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)-病毒相互作用、炎癥應(yīng)答等。Reactome信號通路數(shù)據(jù)庫收集了關(guān)于蛋白質(zhì)相互作用的信息。Reactome信號通路富集結(jié)果顯示，靶點(diǎn)基因主要富集到白細(xì)胞介素和免疫炎癥因子通路上，表明金欣口服液中的類藥成分有可能通過抗病毒免疫發(fā)揮抗COVID-19的作用。

利用75個靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO分析和KEGG代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)基因靶點(diǎn)富集在抗病毒免疫以及抗炎的生物過程和代謝通路上。如KEGG代謝通路富集在T細(xì)胞受體細(xì)胞通路、B細(xì)胞信號受體通路、Toll樣受體信號通路、NOD樣信號受體通路等。BP條目主要富集在炎癥響應(yīng)通路、氧化還原過程、NF-κB信號通路、MAPK信號通路等。此外，富集到G-蛋白偶聯(lián)受體生物與趨化因子表達(dá)相關(guān)。肺部在受到病毒侵襲時，往往會激發(fā)機(jī)體的固有免疫或獲得性免疫[12-15]。本研究結(jié)果顯示，金欣口服液中的類藥性成分可能通過發(fā)揮抗病毒免疫和抗炎作用，從而具有潛在的治療COVID-19的療效。

通過化合物→基因→通路注釋關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析，節(jié)點(diǎn)度最高的兩個靶點(diǎn)基因P35354和P23219分別對應(yīng)于為前列腺素G/H合酶2和前列腺素G/H合酶1，節(jié)點(diǎn)度最高的兩個類藥化合物MOL000098、MOL000422分別對應(yīng)于槲皮素和山奈酚，由此說明金欣口服液通過抗炎發(fā)揮抗病毒功效。本次抗疫情過程中，提到“炎癥風(fēng)暴”是新冠狀病毒患者從輕癥向重癥轉(zhuǎn)化的重要節(jié)點(diǎn)。炎癥風(fēng)暴引起機(jī)體免疫損傷，引起體液中多種細(xì)胞因子產(chǎn)生，是引起多器官衰竭的重要原因[16]。由網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示，金欣口服液具有抗炎抗病毒免疫的作用，提示金欣口服液在間接抗病毒方面，用于新型冠狀病毒肺炎患者，恢復(fù)機(jī)體整體功能具有一定的可行性。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過挖掘數(shù)據(jù)庫中的信息，從整體、多靶角度闡述中藥復(fù)方可能作用的環(huán)節(jié)，為中醫(yī)藥科學(xué)研究提供指導(dǎo)。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘出金欣口服液中可能發(fā)揮用于治療COVID-19的基因靶點(diǎn)，為后期驗(yàn)證工作提供相應(yīng)的理論依據(jù)。需要指出的是，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究多基于數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，而數(shù)據(jù)的信息往往來源于文獻(xiàn)，因此一些熱點(diǎn)化合物和靶點(diǎn)基因在分析過程會被富集，而一些強(qiáng)效的特異性化合物信息可能會丟失。在后期的研究中，應(yīng)基于復(fù)方特色和化合物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇性開展驗(yàn)證工作。