大晶帽石斛再生體系建立研究

吳佩珂　林蔚　李菁　王雪妮　范正陽　孫文忠　何碧珠

摘要? ? 本文以成熟度70%原生大晶帽石斛莢果內(nèi)種子為外植體，探究采用不同消毒時(shí)間、培養(yǎng)基成分構(gòu)成及濃度配比對(duì)大晶帽石斛無菌萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，大晶帽石斛莢果用5%次氯酸鈉消毒15 min，可有效降低污染率;將消毒后莢果種子接入MS+蛋白胨2 g/L+NAA 0.5 mg/L+花寶1號(hào)2 g/L+0.1%活性炭+ 0.58%瓊脂+2%蔗糖培養(yǎng)基中，種子萌發(fā)率達(dá)88%，是適宜大晶帽石斛無菌萌發(fā)的培養(yǎng)基配方。

關(guān)鍵詞? ? 大晶帽石斛;種子;無菌萌發(fā);培養(yǎng)基;消毒時(shí)間

中圖分類號(hào)? ? Q813.1+2? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）09-0141-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract? ? In this paper，the pods with maturity of 70% of Dendrobium macrocephalum was used as explants to study the effects of disinfection time，different composition and concentration of medium on the aseptic germination of Dendrobium macrocephalum.The results showed that disinfect pods with 5% sodium hypochlorite for 15 minutes could effectively reduce the pollution rate after inoculation.The seeds from the sterilized pod were inserted into the medium of MS+2 g/L peptone+0.5 mg/L NAA+2 g/L Huabao No.1+0.1% active charcoal+0.58% agar+2% sucrose，the seed germination rate could reach 88%.This is a suitable medium formula for aseptic germination of Dendrobium macrocephalum.

Key words? ? Dendrobium macrocephalum;seed;aseptic germination;medium;disinfection time

石斛屬（Dendrobium）為蘭科（Orchidaceae）植物最大屬之一，有1 500余種，在我國(guó)有80多種。石斛作為一種名貴中藥材，在我國(guó)有悠久的應(yīng)用歷史。晶帽石斛（Dendrobium crystallinum Rchb. f.）主產(chǎn)于我國(guó)云南省，是一種喜濕、喜陰涼的多年生草本植物，多生長(zhǎng)在溫暖潮濕的熱帶亞熱帶深山老林的疏松樹皮、樹干上或石縫之中[1]。大晶帽石斛莖直立或斜立，不分枝，具多節(jié)，節(jié)間長(zhǎng)3～4 cm，花朵形態(tài)優(yōu)美，氣味芬芳，花色明艷，具有很高的觀賞價(jià)值，被譽(yù)為“四大觀賞洋花”之一[2]。

由于石斛特殊的生物特性，種子無胚乳，大晶帽石斛自然繁殖能力低[3]。目前，對(duì)大晶帽石斛再生體系的研究較少。本試驗(yàn)采用成熟度70%野生大晶帽石斛莢果內(nèi)種子作為外植體，研究不同成分構(gòu)成培養(yǎng)基及添加物用量對(duì)大晶帽石斛種子萌發(fā)的影響，探討莢果消毒時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響，旨在探究適合大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)的條件，以期快速建立再生體系，為大晶帽石斛規(guī)?；a(chǎn)提供理論指導(dǎo)依據(jù)和技術(shù)支持。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為云南文山野生大晶帽石斛莢果，采摘期為2017年12月至2018年1月，莢果皮整體呈綠色，部分泛黃，成熟度為70%[4]。莢果內(nèi)種子呈綠色粘連塊狀。

1.2? ? 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1? ? 不同添加物對(duì)種子萌發(fā)的影響。共設(shè)4個(gè)處理，即添加NAA 0.5 mg/L+花寶1號(hào)2.0 g/L+蛋白胨2.0 g/L（A）、NAA 1.0 mg/L+花寶1號(hào)2.0 g/L（B）、花寶1號(hào)3.0 g/L（C）、蛋白胨3.0 g/L（D）。各個(gè)處理均加入MS+0.1%活性炭+瓊脂0.58%+2%蔗糖，調(diào)制培養(yǎng)基的pH值為5.7。

1.2.2? ? 不同消毒時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)的影響。將預(yù)處理后的種子分別浸泡處理消毒8、10、12、15 min。

1.3? ? 試驗(yàn)方法

1.3.1? ? 莢果預(yù)處理。挑選健康無病、蟲害少、顆粒飽滿、色澤均勻的大晶帽石斛莢果，將莢果一端多余過長(zhǎng)的果柄切除后置于洗衣粉水中漂洗5 min后，流水下沖滴20 min，再用純水沖洗3～4遍后，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)備用。

1.3.2? ? 接種。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用75%酒精浸沒莢果30 s，無菌水沖洗1～2遍，再用5%次氯酸鈉分別浸泡處理消毒，而后用無菌水沖洗3～4遍，取已滅菌的培養(yǎng)皿，用無菌濾紙吸干莢果表面水分，用手術(shù)刀縱向剖開莢果外皮。由于種子成熟度較低，種子難以均勻抖落在培養(yǎng)基上，要用手術(shù)刀和鑷子配合將種子從莢果內(nèi)壁刮夾出來，再均勻接入培養(yǎng)基中。分別標(biāo)注各組培養(yǎng)基以便后期觀察記錄和分析。

1.3.3? ? 培養(yǎng)及觀察。接種后的培養(yǎng)物放置在溫度為（23±2）℃培養(yǎng)室的培養(yǎng)架上暗培養(yǎng)10～20 d[5]，待種子長(zhǎng)出絮狀組織后，逐漸轉(zhuǎn)入光強(qiáng)為500～1 000 lx的正常光照下培養(yǎng)，光照時(shí)間為8～10 h/d，各組不同成分構(gòu)成的培養(yǎng)基區(qū)分放置，每隔10 d觀察并記錄種子萌發(fā)情況和污染情況。

1.3.4? ? 原球莖誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)。接種60 d時(shí)大晶帽石斛種子萌發(fā)生長(zhǎng)出原球莖，原球莖植株茂密嫩綠，可轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。試驗(yàn)中每團(tuán)原球莖切割成較小的簇狀，而后接入MS+蛋白胨2.0 g/L+NAA 0.5 mg/L+花寶1號(hào)2.0 g/L+0.1%活性炭+0.58%瓊脂+2%蔗糖的培養(yǎng)基中，每個(gè)原球莖處理6瓶，培養(yǎng)40 d觀察長(zhǎng)勢(shì)。

1.4? ? 測(cè)定方法與指標(biāo)

接種后需定期觀察每個(gè)處理，分別記錄大晶帽石斛種子的萌發(fā)情況和污染情況。根據(jù)定期記錄的情況，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率，以種子生長(zhǎng)出明顯的絮狀組織作為種子萌發(fā)的標(biāo)志。相關(guān)計(jì)算公式如下：

萌發(fā)率/%=每組萌發(fā)種子粒數(shù)/每組接種種子粒數(shù)×100;

污染率/%=每組污染種子粒數(shù)/每組接種種子粒數(shù)×100。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 不同成分構(gòu)成培養(yǎng)基對(duì)大晶帽石斛無菌萌發(fā)的影響

由表1可知，4種不同成分構(gòu)成的培養(yǎng)基都可以讓大晶帽石斛種子在無菌條件下萌發(fā)，而且各處理之間差異明顯。NAA、花寶1號(hào)和蛋白胨對(duì)大晶帽石斛種子在無菌條件下萌發(fā)均有明顯影響。

2.1.1? ? NAA對(duì)大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)的影響。由表1可知，添加了NAA的處理A、處理B培養(yǎng)基中大晶帽石斛種子的萌發(fā)率分別達(dá)到88%、72%，而沒有添加NAA的處理 C、處理D的萌發(fā)率僅為28%、20%。接種20 d時(shí)4個(gè)處理種子均有不同程度萌發(fā)，而40～60 d，處理C完全停止生長(zhǎng)并死亡，處理D生長(zhǎng)緩慢。由此可見，NAA可以顯著提高大晶帽石斛種子在無菌條件下的萌發(fā)率，生長(zhǎng)期可以提供種子生長(zhǎng)所需物質(zhì)，但過高濃度的NAA在短時(shí)間內(nèi)若不及時(shí)轉(zhuǎn)接，則不利于增殖誘導(dǎo)。

2.1.2? ? 花寶1號(hào)對(duì)大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)的影響。一般來說，花寶1號(hào)成分主要有N、P、K，為大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)過程中提供萌發(fā)所需物質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果表明，加入花寶1號(hào)的處理A、處理B、處理C中種子在20 d的萌發(fā)率較處理D高，而未加入花寶1號(hào)處理D的大晶帽石斛萌發(fā)率最低，僅為16%。60 d時(shí)處理D與處理C相比，種子褐化程度較高。由此可見，花寶1號(hào)有促進(jìn)大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)的作用，并且可以抑制種子褐化現(xiàn)象產(chǎn)生。

2.1.3? ? 蛋白胨對(duì)大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)的影響。蛋白胨作為培養(yǎng)基的重要組成成分，主要提供給植物生長(zhǎng)所需的有機(jī)碳源和氮源。當(dāng)試驗(yàn)進(jìn)行60 d時(shí)，缺少蛋白胨的處理B和處理C的種子生長(zhǎng)不及處理A旺盛，但早期萌發(fā)時(shí)處理A種子萌發(fā)率與其他組區(qū)別不明顯。由此可見，蛋白胨對(duì)大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)影響較小，但具有為其生長(zhǎng)提供養(yǎng)分的作用。

2.2? ? 不同消毒時(shí)間對(duì)大晶帽石斛無菌萌發(fā)的影響

大晶帽石斛種子從接種到萌發(fā)所需時(shí)間為20 d左右，但是不同消毒時(shí)間處理的種子所需時(shí)間不一致。由表2可知，相同成熟度的種子進(jìn)行不同消毒時(shí)間的處理，萌發(fā)率會(huì)出現(xiàn)顯著差異。不同消毒時(shí)間處理對(duì)大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)具有較明顯的影響，這與俞婷婷等[1]研究結(jié)果相符。當(dāng)次氯酸鈉消毒時(shí)間最長(zhǎng)為15 min時(shí)，污染率最低，為12%，萌發(fā)率最高，為88%，消毒效果最好;當(dāng)消毒時(shí)間為12 min時(shí)，污染率升高為24%，萌發(fā)率降低為72%，消毒效果降低;當(dāng)消毒時(shí)間為10 min時(shí)，污染率達(dá)60%，萌發(fā)率降低為28%，消毒效果不足;當(dāng)消毒時(shí)間為8 min時(shí)，污染率最高，達(dá)80%，萌發(fā)率僅為20%。綜上可知，大晶帽石斛種子最佳消毒時(shí)間在15 min內(nèi)，隨著消毒時(shí)間增加，消毒效果逐漸加強(qiáng)，由于大晶帽石斛莢果皮較厚，在沒有破壞莢果皮的情況下，種子活性不會(huì)被影響。當(dāng)大晶帽石斛莢果的消毒時(shí)間為15 min 時(shí)，可以有效降低大晶帽石斛種子接種后的污染率。

3? ? 結(jié)論與討論

3.1? ? 外植體的選擇

由于大晶帽石斛種子非常微小，胚多半不成熟或發(fā)育不全，無胚乳[6]。本試驗(yàn)中所使用外植體材料為成熟度70%原生大晶帽石斛莢果，莢果中種子由于成熟度不高，種子成塊粘連，不能自然抖落呈粉末狀，使得接種時(shí)種子必須成團(tuán)接入培養(yǎng)基中，但當(dāng)經(jīng)過在適宜的誘導(dǎo)萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d時(shí)，可以形成大量綠色原球莖。因此，大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)時(shí)，可以選擇成熟度在70%左右、顆粒飽滿、無病蟲害、色澤均勻的健康莢果作為外植體。

3.2? ? 培養(yǎng)基成分構(gòu)成

培養(yǎng)基成分構(gòu)成的選擇對(duì)種子的無菌萌發(fā)至關(guān)重要，構(gòu)成和各成分用量不同的培養(yǎng)基對(duì)種子的無菌萌發(fā)影響各不相同[7-9]。汪紅梅等[10]進(jìn)行鐵皮石斛種子無菌萌發(fā)試驗(yàn)時(shí)，使用MS改良培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加2.0%土豆煮熟汁液、2.0%蔗糖、0.65%瓊脂和0.1 mg/L NAA作為種子萌發(fā)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基滅菌前pH值為5.7，種子能正常萌發(fā)，且萌發(fā)率達(dá)90%以上。姚志軍等[11]進(jìn)行齒瓣石斛種子無菌萌發(fā)試驗(yàn)時(shí)，選用花寶1號(hào)（N∶P∶K為7∶6∶19）3 g/L+LH（水解乳蛋白）1 g/L+蔗糖25 g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8～6.2，能在40～45 d獲得大量直徑1 mm左右的原球莖。本試驗(yàn)中4個(gè)處理培養(yǎng)基種子均有萌發(fā)，但MS+花寶1號(hào)3 g/L+0.1%活性炭+0.58%瓊脂+2%蔗糖培養(yǎng)基和MS+蛋白胨 3 g/L+0.1%活性炭+0.58%瓊脂+2%蔗糖培養(yǎng)基中的種子在萌發(fā)絮狀組織后迅速死亡，或者生長(zhǎng)較緩慢。由此可知，過量添加蛋白胨和花寶1號(hào)不利于原球莖的誘導(dǎo)，即可說明這2種培養(yǎng)基均不適宜用作大晶帽石斛的無菌萌發(fā)。MS+花寶1號(hào)2 g/L+NAA 1 mg/L+0.1%活性炭+0.58%瓊脂+2%蔗糖培養(yǎng)基能夠順利長(zhǎng)出原球莖，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)60 d時(shí)，原球莖全部老化死亡，說明該培養(yǎng)基不適宜用于大晶帽石斛的無菌萌發(fā)。MS+蛋白胨2 g/L+NAA 0.5 mg/L+花寶1號(hào)2 g/L+0.1%活性炭+0.58%瓊脂+2%蔗糖培養(yǎng)基中種子萌發(fā)率最高，全部生長(zhǎng)出綠色原球莖，并且植株健康、色澤均勻，說明該培養(yǎng)基配置適合大晶帽石斛的無菌萌發(fā)[12]，適量的蛋白胨與花寶1號(hào)配合使用可以誘導(dǎo)原球莖增殖。

3.3? ? 消毒時(shí)間選擇

大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)率受消毒時(shí)間的影響較大。在種子無菌萌發(fā)試驗(yàn)中消毒時(shí)間的選擇要衡量滅菌徹底和保持種子生物活性。消毒時(shí)間過短，滅菌不徹底，種子的污染率極高;消毒時(shí)間過長(zhǎng)，種子活性被破壞，導(dǎo)致種子死亡，萌發(fā)率低[13]。本試驗(yàn)表明，大晶帽石斛莢果在消毒15 min內(nèi)污染率隨消毒時(shí)間的增加而降低，死亡率無明顯變化。可能是因?yàn)榇缶笔那v果皮較厚，對(duì)莢果內(nèi)種子保護(hù)較好，所以消毒時(shí)間為15 min未影響種子活性。綜上所述，大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)對(duì)成熟且未開裂的莢果進(jìn)行15 min消毒比較適宜。

3.4? ? 原球莖增殖

當(dāng)大晶帽石斛經(jīng)過25 d原球莖增殖增養(yǎng)后需要進(jìn)行轉(zhuǎn)接擴(kuò)大繁殖。本試驗(yàn)在轉(zhuǎn)接10 d后，原球莖沒有出現(xiàn)增殖或死亡現(xiàn)象，說明培養(yǎng)基基本配比可以讓原球莖繼續(xù)生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度較慢，可能是原球莖沒有適應(yīng)新生長(zhǎng)環(huán)境，或是切割傷口的恢復(fù)所需時(shí)間較長(zhǎng)。莫昭展等[14]在進(jìn)行鐵皮石斛原球莖的增殖研究表明，原球莖轉(zhuǎn)接10 d后開始增殖，40 d時(shí)增殖速度達(dá)到最高，所得結(jié)論與本試驗(yàn)結(jié)果相符合。韓曉紅等[15]的金線蓮原球莖增殖試驗(yàn)表明，不同的基本培養(yǎng)基對(duì)原球莖增殖效率影響顯著，其中B5培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基的增殖效率相對(duì)較高。本試驗(yàn)中添加0.1 mg/L NAA也能促進(jìn)原球莖的增殖，但是效果不明顯，增殖效率低。

3.5? ? 活性炭影響

王平紅[7]認(rèn)為，在培養(yǎng)基中加入適量的活性炭，可以吸附具有抑制作用的化合物和植物激素。當(dāng)植物生長(zhǎng)素的含量大于細(xì)胞分裂素時(shí)，有利于種子萌發(fā)生根，還可以防止植物組織褐化、老化。有學(xué)者在進(jìn)行安祖花人工種子的制備中添加了0.1%活性炭，不僅能夠提高種子在無菌環(huán)境下的萌發(fā)率，還能有效抑制黃化和褐化。李樹麗[9]認(rèn)為活性炭用量超過2%會(huì)抑制生根。因此，本試驗(yàn)中所有培養(yǎng)基均添加0.1%活性炭，以促進(jìn)種子萌發(fā)，防止褐化。

本試驗(yàn)通過比較不同培養(yǎng)基構(gòu)成、不同添加物用量、不同消毒時(shí)間對(duì)大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)的影響，旨在探究適合大晶帽石斛種子無菌萌發(fā)的條件，結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加適量的NAA、花寶1號(hào)、活性炭和蛋白胨均對(duì)提高種子萌發(fā)率有幫助[16]。另外，用5%次氯酸鈉對(duì)大晶帽石斛莢果消毒15 min，可以有效抑制接種后培養(yǎng)基的污染。然而，本試驗(yàn)內(nèi)容還不夠全面，一些有助于植物組織生根的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以在以后的試驗(yàn)中加入。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)一些問題，即添加NAA 0.5 mg/L+花寶1號(hào)2.0 g/L+蛋白胨2.0 g/L培養(yǎng)基中愈傷組織較多，影響生長(zhǎng)和觀察，原因可能是蛋白胨導(dǎo)致培養(yǎng)基中氮源過多，愈傷組織生長(zhǎng)過旺;添加NAA 1.0 mg/L+花寶1號(hào)2.0 g/L培養(yǎng)基中種子會(huì)形成原球莖，之后原球莖迅速衰老死亡，其原因可能是NAA含量過高，NAA能促進(jìn)細(xì)胞的分裂，添加1 mg/L NAA之后種子萌發(fā)迅速，但尚未及時(shí)轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中，原球莖便會(huì)快速衰亡，因而應(yīng)該掌握適宜時(shí)期，在長(zhǎng)出原球莖后盡快轉(zhuǎn)移進(jìn)行增殖栽培，實(shí)現(xiàn)大晶帽石斛人工繁育產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[17]。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)大晶帽石斛種子的無菌萌發(fā)再生體系進(jìn)行了研究，所得結(jié)論可以為大晶帽石斛的規(guī)?；a(chǎn)提供一定的數(shù)據(jù)支持及參考。

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