紫蘇Pfgpat9基因的鑒定與功能分析

任文燕，郝月茹，李潤(rùn)植，周雅莉，楊宏斌，王計(jì)平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 太谷 030801)

紫蘇[Perillafrutescens(L.)Britt.]，又名香蘇、白蘇、赤蘇，為一年生自花授粉作物，是國(guó)家衛(wèi)生部頒布的首批兼保健藥用、食用的60種植物之一[1-4]，在中國(guó)種植已經(jīng)有2 000多年的歷史。紫蘇種子富含油脂，含油率可達(dá)46%～55%，油脂中含多種脂肪酸，主要包括亞麻酸(C18∶3)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)等不飽和脂肪酸[5]，其中人體必需脂肪酸α-亞麻酸含量高達(dá)55%～65%，比大豆等油料作物α-亞麻酸含量高出5倍左右[6]。

甘油三磷酸?；D(zhuǎn)移酶(glyceryl triphosphate acyltransferase，GPAT)是三酰甘油(triacylglycerol，TAG)生物合成的限速酶[7,8]，催化Kennedy途徑的第一步反應(yīng)，主要將酰基從acyl-ACP或acyl-CoA轉(zhuǎn)移到甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate，G3P)的sn-1位置上形成溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)[9-11]。目前已經(jīng)在擬南芥中鑒定出10個(gè)gpat基因[12-14]，已有研究表明，擬南芥gpat9(Atgpat9)在TAG的生物合成中起直接作用[12,15]。Shockey等[16]研究表明，使用人工合成的miRNA使Atgpat9基因沉默，降低了擬南芥種子油含量。Singer等[17]發(fā)現(xiàn)Atgpat9在擬南芥發(fā)育葉片的極性脂質(zhì)、TAG的生物合成以及花粉粒脂滴的合成中起重要作用。Jain等[18]將克隆到的紅花質(zhì)體gpat基因轉(zhuǎn)化至擬南芥，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子含油量比野生型增加了10%～21%。Miriam等[19]在酵母互補(bǔ)試驗(yàn)中表達(dá)向日葵gpat9(Hagpat9) 基因，使酵母TAG總量增加，并且脂肪酸組分也發(fā)生了改變，表現(xiàn)在C16∶0和C16∶1脂肪酸的富集。目前，已經(jīng)在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[20]、甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)[21]、向日葵(Helianthusannuus)[22]等多種植物中克隆到gpat基因，并且異源表達(dá)該基因可以提高宿主組織的油脂含量。而關(guān)于紫蘇gpat9(Pfgpat9)基因的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究基于前期紫蘇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中獲得的高表達(dá)gpat基因的轉(zhuǎn)錄本，以‘晉紫蘇1號(hào)’發(fā)育前期(開(kāi)花后20 d)的種子為試驗(yàn)材料，利用RT-PCR技術(shù)克隆得到Pfgpat9基因完整的開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)序列，并分析該基因在不同器官組織的表達(dá)特性。構(gòu)建酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化至野生型酵母INVSc1和缺陷型酵母gat1，分析轉(zhuǎn)基因酵母脂肪酸組分及含量，鑒定Pfgpat9基因的生物學(xué)功能。該研究為深入解析紫蘇油脂合成分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用紫蘇品種為‘晉紫蘇1號(hào)’，2018年4月種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地，對(duì)紫蘇根、莖、葉、花及四個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的種子(即開(kāi)花后10、20、30、40 d)分別取樣，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。大腸桿菌感受態(tài)DH5α、試驗(yàn)所用克隆載體pMD18-T、表達(dá)載體pYES2.0、釀酒酵母野生型菌株INVSc1和缺陷型菌株gat1均保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫蘇總RNA提取及cDNA合成

采用EASY spin Plus RNA 快速提取試劑盒(RN09，北京艾德萊生物科技有限公司)提取紫蘇RNA，反轉(zhuǎn)錄參考ABM公司5X All-In-One MasterMix(with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成。

1.2.2Pfgpat9基因的克隆

本試驗(yàn)從紫蘇轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行篩選比對(duì)，獲得高表達(dá)的編碼甘油三磷酸?；D(zhuǎn)移酶9轉(zhuǎn)錄本，命名為Pfgpat9。以該轉(zhuǎn)錄本序列為模板，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物(表1)，按照全式金2×EasyTaq?PCR SuperMix說(shuō)明書(shū)的反應(yīng)體系與反應(yīng)程序；以紫蘇開(kāi)花后20 d的種子cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；割膠回收PCR產(chǎn)物后，將其克隆至pMD18-T載體上，得到pMD18-T-Pfgpat9并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；菌液PCR鑒定篩選陽(yáng)性克隆，送通用生物公司(安徽)進(jìn)行測(cè)序鑒定。

表1 引物信息Tab.1 Primer information used in this study

1.3 Pfgpat9基因的生物信息學(xué)分析

使用在線軟件ProParam對(duì)PfGPAT9蛋白的理論等電點(diǎn)、分子量、不穩(wěn)定性等進(jìn)行分析。采用軟件TMHMM對(duì)PfGPAT9的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)在線軟件SOPMA和SWISS-MODEL對(duì)PfGPAT9蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和建模。利用NCBI-CDD預(yù)測(cè)PfGPAT9蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。采用在線軟件PRALINE program對(duì)紫蘇PfGPAT9與其他物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。運(yùn)用MEGA7.0對(duì)紫蘇和其他物種的GPAT9蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用ABM公司的EvaGreen 2× qPCR試劑盒，并設(shè)計(jì)qPCR引物(表1)，以18S rRNA作為內(nèi)參基因[23]，進(jìn)行PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系(10 μL)為：cDNA模板0.5 μL，正反向引物各0.3 μL，EvaGreen 2× qPCRMaster Mix 5 μL，Nuclease-free H2O 3.9 μL，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)程序采用兩步法進(jìn)行：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算紫蘇Pfgpat9基因的相對(duì)表達(dá)量[24]。所得數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 Pfgpat9基因酵母表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

本試驗(yàn)所用酵母表達(dá)載體為pYES2.0，含URA3位點(diǎn)和氨芐青霉素抗性。Pfgpat9基因通過(guò)EcoR I和NotI雙酶切連接到pYES2.0中形成重組酵母表達(dá)載體pYES2.0-Pfgpat9，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行菌液PCR鑒定，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。

將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒和空載體分別轉(zhuǎn)化至野生型酵母菌株INVSc1和缺陷型菌株gat1，28 ℃培養(yǎng)2～4 d后通過(guò)菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆菌株，用于后續(xù)試驗(yàn)。菌液PCR體系(20 μL)為：菌液0.4 μL，2×San Taq PCR Mix 10 μL，10 μmol/L正反引物(Pfgpat9基因檢測(cè)引物為Pfgpat9-F和Pfgpat9-R，空載對(duì)照質(zhì)粒檢測(cè)引物為T(mén)7和CYC1)各0.8 μL、dd H2O 8 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃終延伸10 min。

培養(yǎng)酵母細(xì)胞的方法參考徐榮華[25]、譚太龍[26]等，將轉(zhuǎn)Pfgpat9基因的酵母與轉(zhuǎn)空載體對(duì)照質(zhì)粒的酵母在SC-U(synthetic minimal defined medium lacking uracil)抑制培養(yǎng)基(2%葡萄糖)中培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)至SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基(2%半乳糖)中繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)36 h后離心收集菌體，冷凍干燥后進(jìn)行脂肪酸含量與組分分析。

1.6 轉(zhuǎn)基因酵母的總脂肪酸含量測(cè)定及脂肪酸組分分析

總脂肪酸的提取及測(cè)定：試驗(yàn)采用甲醇與氯仿抽提的方法來(lái)提取總脂。稱(chēng)取50 mg轉(zhuǎn)基因酵母菌體粉末置于離心管中，加入甲醇與氯仿(體積比為2∶1)混合液7.5 mL，37 ℃提取24 h；再次加入甲醇與氯仿混合液7.5 mL，提取12 h，抽提2次。將三次所得有機(jī)相混合，再加入一定比例1% NaCl溶液和氯仿溶液，離心吸取下層有機(jī)相至已經(jīng)稱(chēng)重的新離心管m0，氮吹儀吹干后稱(chēng)管重m1，每個(gè)樣品3次重復(fù)。總脂肪酸含量=(氮吹儀吹干后的管重m1-加樣前的管重m0)/酵母菌體粉末重量。

脂肪酸的提取與組分分析參考王計(jì)平等[23]分析方法。試驗(yàn)使用Tri 17∶0作為內(nèi)標(biāo)，用2.5%甲醇(濃硫酸)進(jìn)行甲酯化，80 ℃水浴2 h，用0.4 mL正己烷溶解脂肪酸，轉(zhuǎn)至GC瓶用于氣相檢測(cè)。用安捷倫氣相色譜儀7890B對(duì)脂肪酸各組分含量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pfgpat9基因的克隆

以紫蘇開(kāi)花后20 d的種子cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，割膠回收目的片段，純化測(cè)序，獲得一條1 116 bp的核苷酸序列，并且測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)分析結(jié)果一致，確定該片段為Pfgpat9基因序列(圖1)。

圖1 Pfgpat9基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of the amplified PCR product of Pfgpat9 M：DL2000 Marker；1：Pfgpat9基因擴(kuò)增產(chǎn)物M:DL2000 Marker;1:The PCR product of Pfgpat9

2.2 Pfgpat9基因編碼蛋白的序列特征

2.2.1PfGPAT9蛋白的理化性質(zhì)

對(duì)Pfgpat9基因的序列結(jié)構(gòu)分析表明(圖2)，Pfgpat9基因的ORF為1 116 bp，共編碼371個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子量為42.92 kD，理論等電點(diǎn)(pI)為8.96，不穩(wěn)定系數(shù)為46.67，平均親水系數(shù)為-0.108，脂質(zhì)指數(shù)為93.45，因此推導(dǎo)該蛋白質(zhì)為親水性不穩(wěn)定蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)域結(jié)果分析顯示：PfGPAT9蛋白分別在第69～91位、95～117位和130～147位氨基酸之間存在3個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)。

圖2 Pfgpat9 ORF序列及編碼的氨基酸序列Fig.2 Sequence of Pfgpat9 ORF and the translated amino acid sequence

運(yùn)用SOPMA軟件對(duì)PfGPAT9蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋(40.16%)、無(wú)規(guī)則卷曲(31.81%)、延伸鏈(21.02%)、β-折疊(7.01%)。其中，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是PfGPAT9蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件。

利用SWISS-MODEL在線軟件以結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)GPAT蛋白[27]為模板(圖3b)，對(duì)PfGPAT9蛋白進(jìn)行同源建模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PfGPAT9蛋白與模板蛋白的序列相似性為64%，氨基酸保守序列范圍為104～347位氨基酸，表明建立的模型可信度高。對(duì)比圖3a和圖3b可以發(fā)現(xiàn)，PfGPAT9蛋白與模板蛋白的外形結(jié)構(gòu)高度相似，可以推測(cè)PfGPAT9蛋白與模板蛋白有著相同的亞基BMA(beta-D-mannose)(圖3c)和PLM(palmitic acid)(圖3d)。NCBI-CDD分析該蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)PfGPAT9蛋白含有PLN02833保守結(jié)構(gòu)域，屬于溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶(lysophospholipid acyltransferase superfamily，LPLAT)超家族中的成員。

圖3 PfGPAT9蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 The tertiary structure prediction of GPAT9 protein in Perilla frutescens (a)PfGPAT9蛋白的三維結(jié)構(gòu)；(b)結(jié)核分枝桿菌蛋白的三維結(jié)構(gòu)；(c)配體BMA；(d)配體PLM(a)Tertiary structure of PfGPAT9 protein of Perilla frutescens;(b)Tertiary structure of Mycobacterium tuberculosis;(c)Ligand BMA;(d)Ligand PLM

2.2.2PfGPAT9蛋白多序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)PRALINE program對(duì)紫蘇、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)、甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)、油桐(Verniciafordii)等植物的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。序列比對(duì)分析表明(圖4):GPAT9蛋白的分化程度較低，氨基酸序列高度保守，相似度高達(dá)90%以上；GPAT9蛋白具有典型的?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，并且包含4個(gè)高度保守的基序。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示(圖5)，紫蘇與油橄欖(Oleaeuropaea)的親緣關(guān)系最近。

2.3 Pfgpat9基因表達(dá)特性分析

選取紫蘇根、莖、葉、花及四個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的種子為材料，對(duì)Pfgpat9基因進(jìn)行表達(dá)特性分析。結(jié)果表明(圖6)：該基因在紫蘇根、莖、葉、花及種子中均有表達(dá)，其中在種子中的表達(dá)量明顯高于其他組織，并且在種子不同發(fā)育時(shí)期，該基因的表達(dá)量存在顯著差異，在開(kāi)花后20 d表達(dá)量達(dá)到最高，為開(kāi)花后10 d的2.47倍。

2.4 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

利用EcoR I和NotI對(duì)重組質(zhì)粒pYES2.0-Pfgpat9進(jìn)行雙酶切，以空載體作為對(duì)照。圖7為雙酶切后的電泳圖，其中第一泳道為雙酶切后得到的目的基因條帶，其長(zhǎng)度大小為1 116 bp，與目的基因Pfgpat9的長(zhǎng)度大小一致，第二泳道為空載體(5.9 kb)。這說(shuō)明酵母表達(dá)載體pYES2.0-Pfgpat9構(gòu)建成功，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 轉(zhuǎn)基因酵母的陽(yáng)性鑒定

將構(gòu)建好的酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)入野生型酵母INVSc1和缺陷型酵母gat1中，使用SC-U誘導(dǎo)培養(yǎng)基(2%半乳糖)進(jìn)行篩選，挑取單克隆菌落培養(yǎng)后進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8，均擴(kuò)增出目的條帶，表明目的基因已成功轉(zhuǎn)入酵母中。

圖4 不同物種的GPAT9氨基酸序列比對(duì)分析(黑色方框代表GPAT9保守結(jié)構(gòu)域)Fig.4 Sequence alignment of GPAT9 proteins from different plant species (Black box represents the GPAT9 conserved motifs)

圖5 PfGPAT9與其他物種GPAT9蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic tree of GPAT9 proteins of Perilla frutescens and other species Oe：油橄欖；Cs：茶樹(shù)；Ha：向日葵；Ca：小果咖啡；Pt：黑色楊木；At：擬南芥；Bn：甘藍(lán)型油菜；Vf：油桐；Sl：番茄；Zj：棗；Eg：非洲油棕；Gm：大豆； Sa：海藻施萬(wàn)氏菌Oe:Olea europaea;Cs:Camellia sinensis;Ha:Helianthus annuus;Ca:Coffea arabica;Pt:Populus trichocarpa;At:Arabidopsis thaliana;Bn:Brassica napus;Vf:Vernicia fordii;Sl:Solanum lycopersicum;Zj:Ziziphus jujuba;Eg:Elaeis guineensis;Gm:Glycine max;Sa:Shewanella algae

圖7 酵母表達(dá)載體雙酶切鑒定Fig.7 Double digestion of the yeast expression vectorM：DL12000 Marker；1：pYES2.0-Pfgpat9雙酶切結(jié)果；2：空載體pYES2.0M:DL12000 Marker;1:Double digested electrophoresis of pYES2.0-Pfgpat9;2:pYES2.0 vector

圖8 轉(zhuǎn)Pfgpat9菌液PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.8 Detection of Pfgpat9 colony PCR products were analyzed on agarose gels(a)M：DL2000 Marker；1～3：INVSc1轉(zhuǎn)空載對(duì)照質(zhì)粒pYES2.0；4～6：INVSC1轉(zhuǎn)pYES2.0-Pfgpat9；(b)M：DL2000 Marker；1～3：gat1轉(zhuǎn)pYES2.0-Pfgpat9；4～6：gat1轉(zhuǎn)空載對(duì)照質(zhì)粒pYES2.0(a)M:DL2000 Marker;1～3:INVSc1 transformed with empty pYES2.0;4～6:INVSc1 transformed with pYES2.0-Pfgpat9;(b)M:DL2000 Marker;1～3:gat1 transformed with pYES2.0-Pfgpat9;4～6:gat1 transformed with empty pYES2.0

2.6 轉(zhuǎn)基因酵母脂肪酸含量及組分分析

選擇野生型INVSc1、缺陷型gat1、轉(zhuǎn)野生型空載體、gat1-pYES2.0空載體、轉(zhuǎn)pYES2.0-Pfgpat9野生型酵母、轉(zhuǎn)pYES2.0-Pfgpat9缺陷型酵母菌株進(jìn)行總脂肪酸含量、脂肪酸組分及含量的測(cè)定。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因INVSc1酵母總脂肪酸含量比轉(zhuǎn)空載酵母(empty vector，EV)提高了2.2%，比野生型酵母總脂含量高1.01%(圖9a)，轉(zhuǎn)基因gat1酵母總脂肪酸含量比EV提高了1.55%，比缺陷型酵母總脂含量高1.68%(圖9b)。各脂肪酸組分及含量分析表明，轉(zhuǎn)基因INVSc1酵母與EV相比C16∶0、C16∶1、C18∶1含量均有所提高，分別提高了14.57 %、15.28%和1.12%，C18∶0含量減少0.84%，并且轉(zhuǎn)基因酵母新合成了C18∶2，其含量為7.28%，與野生型酵母相比C16∶0、C16∶1、C18∶1分別提高了14.44%、16.42%、1.5%，C18∶0含量減少0.99%(圖10a)。轉(zhuǎn)基因gat1酵母與EV相比C16∶0、C16∶1、C18∶0均有所提高，分別提高7.33%、23.52%和8.22%，C18∶1含量減少1.62%，與缺陷型酵母相比C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1均提高，分別提高了12.55%、19.74%、8.34%和2.18%(圖10b)。轉(zhuǎn)基因酵母油脂成分的變化充分證明了該基因參與酵母細(xì)胞的油脂合成代謝。

圖9 轉(zhuǎn)基因酵母總脂肪酸含量Fig.9 Total lipids content in the transgenic yeast(a)野生型酵母總脂肪酸含量；(b)缺陷型酵母總脂肪酸含量(a)Total lipids content in the INVSc1;(b)Total lipids content in the gat1

圖10 轉(zhuǎn)基因酵母的脂肪酸組分分析Fig.10 Composition analysis of fatty acids in transgenic yeasts(a)野生型酵母的脂肪酸組分分析；(b)缺陷型酵母的脂肪酸組分分析(a)Composition analysis of fatty acids in INVSc1; (b)Composition analysis of fatty acids in gat1

3 討論

GPAT是油料作物油脂合成積累途徑中催化三酰甘油生物合成第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶。目前，已從擬南芥、向日葵、油桐等植物中克隆到gpat9基因，并通過(guò)試驗(yàn)證明過(guò)表達(dá)該基因可以使TAG的含量顯著升高[17]。本研究克隆獲得紫蘇Pfgpat9基因，并對(duì)其編碼蛋白序列特征進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，該基因ORF序列長(zhǎng)為1 116 bp，編碼371個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為42.92 kD。對(duì)PfGPAT9蛋白特性分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)分析表明，PfGPAT9蛋白存在3個(gè)跨膜區(qū)，這與AtGPAT9蛋白含有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的特征一致[12]。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，PfGPAT9蛋白具有?；D(zhuǎn)移酶活性結(jié)構(gòu)域，符合GPAT酶蛋白的典型特征，對(duì)PfGPAT9蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，紫蘇PfGPAT9與油橄欖、茶樹(shù)等親緣關(guān)系較近，而與大豆、油棕的關(guān)系較遠(yuǎn)。

植物種子發(fā)育過(guò)程中，TAG積累模式為：在發(fā)育初期油脂積累緩慢，發(fā)育中期TAG快速積累，在種子發(fā)育后期TAG趨于飽和，合成量降低[26]。本研究通過(guò)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，Pfgpat9基因在紫蘇的各個(gè)器官中均有表達(dá)，但在種子中的表達(dá)量顯著高于其它器官，在開(kāi)花后20 d種子中表達(dá)量最高，這與向日葵[19]Hagpat9基因和擬南芥[17]Atgpat9基因表達(dá)趨勢(shì)基本一致。Pfgpat9基因表達(dá)模式與種子發(fā)育過(guò)程中油脂積累模式相一致，表明兩者之間呈現(xiàn)正相關(guān)，推測(cè)Pfgpat9基因在紫蘇種子油脂合成積累中起重要作用。

Sui等[28]研究結(jié)果表明，番茄gpat基因的過(guò)量表達(dá)增加了類(lèi)囊體膜中的不飽和脂肪酸含量；陳文玲等[29]發(fā)現(xiàn)gpat9直接參與真核細(xì)胞中膜脂和油脂的合成；張楠等[30]在酵母中異源表達(dá)小桐子gpat基因,顯著提高了酵母的總含油量。為進(jìn)一步鑒定紫蘇Pfgpat9基因的功能，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)化野生型酵母和缺陷型酵母，對(duì)轉(zhuǎn)基因酵母總油脂及其脂肪酸組分進(jìn)行分析，結(jié)果表明，Pfgpat9基因顯著提高了酵母總脂肪含量，且引起了酵母脂肪酸組分的變化，在轉(zhuǎn)野生型酵母中新合成了C18∶2，并且C16∶0、C16∶1、C18∶1含量均有所提高，在轉(zhuǎn)缺陷型酵母中C16∶0、C16∶1、C18∶0含量均提高。Miriam等[19]在酵母互補(bǔ)試驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)Hagpat9增加了酵母細(xì)胞中C16∶0和C16∶1脂肪酸的含量，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

本文從紫蘇發(fā)育種子中成功克隆Pfgpat9基因，其編碼蛋白具有較高的GPAT酶活性，異源表達(dá)結(jié)果表明，Pfgpat9基因可顯著促進(jìn)宿主組織總油脂合成以及C16∶1脂肪酸的富集。本研究為深入解析紫蘇種子油脂合成機(jī)制及用于其他油料作物品質(zhì)改良提供了新技術(shù)和新的基因元件。