新型冠狀病毒肺炎患者淋巴細(xì)胞及炎性指標(biāo)的動態(tài)分析

郭斌 ，王強(qiáng) ，任冠宇 ，杜琴 ，唐西 ，郭楊柳 ，謝寧 ，黃義山 ，郭曉蘭 （通信作者）

川北醫(yī)學(xué)院 1 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，2 附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，3 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心 （四川南充 637000）

新型冠狀病毒是一種在人體中新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒亞群，目前認(rèn)為其來源于野生動物，并具有較強(qiáng)的傳染性[1-2]。新型冠狀病毒感染患者主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、全身乏力、肺炎等癥狀，重癥肺部感染患者易出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征，進(jìn)而導(dǎo)致呼吸衰竭、酸堿平衡紊亂和臟器損傷等并發(fā)癥[3-5]。世界衛(wèi)生組織最新報告顯示，新型冠狀病毒感染患者較嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome,SARS）患者病情進(jìn)展不確定性更大，約80%患者以感冒輕癥為主，表現(xiàn)為自限性疾病，但具有傳染性；約15%患者出現(xiàn)肺炎，需要抗感染治療；約5%患者疾病進(jìn)展快，病情兇險，需要進(jìn)ICU治療；這種不確定性特征給臨床救治帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[6]。

目前，實(shí)驗(yàn)室病毒核酸檢測和肺CT影像是診斷和監(jiān)測新型冠狀病毒感染的重要依據(jù)，但是，核酸檢測假陰性的存在給臨床帶來了困擾，而陽性率較高的咽拭子、痰液和肺泡灌洗液由于受采樣量的影響，均無法對病毒進(jìn)行準(zhǔn)確定量，難以持續(xù)反映病情進(jìn)展情況；放射性成像由于受到檢測環(huán)境和頻次的制約也有局限性[7-8]。相對而言，血液標(biāo)本易于采集，且已有報道指出，針對病毒感染，血液中特定細(xì)胞數(shù)和炎性指標(biāo)水平均在疾病診斷和監(jiān)測中具有重要價值[9-10]，因此，探索這些指標(biāo)在新型冠狀病毒感染患者病程中的動態(tài)變化，篩選潛在的抗感染評估指標(biāo)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[11]。

本研究報道了新型冠狀病毒定點(diǎn)救治醫(yī)院（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）早期收治的4例新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）患者流行病學(xué)史、臨床癥狀和入院檢查結(jié)果，分析了潛在的輔助診斷指標(biāo)，連續(xù)記錄了患者在疾病治療過程中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及炎性指標(biāo)的水平變化，通過比較各指標(biāo)與臨床肺部感染評分（CPIS）的相關(guān)性，為應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)評估患者抗肺部感染療效、制定治療方案提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以國家衛(wèi)生健康委員會辦公廳、國家中醫(yī)藥管理局辦公室印發(fā)的《關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版 修正版）的通知》為依據(jù)，納入確診病例和進(jìn)行疾病診斷與病情分級。確診依據(jù)為：（1）呼吸道標(biāo)本或血液標(biāo)本實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測新型冠狀病毒核酸陽性；（2）呼吸道標(biāo)本或血液標(biāo)本病毒基因測序，與已知的新型冠狀病毒高度同源。醫(yī)院2020年1月22日至2月10日收治了核酸檢測陽性的確診COVID-19患者4例，其中男2例，女2例；年齡46～77歲；入院判定為普通型2例，重型2例（1例迅速發(fā)展為危重型）。4例患者的臨床信息使用均遵照醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 方法

定期采集所有隔離治療患者的咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、動脈血、清晨非輸液端靜脈血（包括EDTA抗凝、肝素抗凝、枸櫞酸鹽抗凝和無抗凝劑血液標(biāo)本），無抗凝管標(biāo)本于36 ℃下孵育1 h 后，經(jīng)3 500×g/min 離心10 min 分離血清。在嚴(yán)格質(zhì)量控制下，采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測新型冠狀病毒核酸（LightCycler96，之江試劑）；采用血?dú)夥治鰞x測定患者氧分壓水平（GEM Premier 4000），采用全血細(xì)胞計數(shù)（BC 6800）、流式細(xì)胞術(shù)（BD FACSCanto Ⅱ）和紅細(xì)胞沉降動態(tài)掃描法（LDY2CX40）檢測患者全血標(biāo)本白細(xì)胞（WBC）總數(shù)、淋巴細(xì)胞（LYM）總數(shù)、CD3 T 淋巴細(xì)胞數(shù)（CD3 T）、CD4 T淋巴細(xì)胞數(shù)（CD4 T）、CD8 T 淋巴細(xì)胞數(shù)（CD8 T）和紅細(xì)胞沉降率（ESR）；采用免疫散射比濁法檢測患者C反應(yīng)蛋白（CRP）水平（BECKMAN AU5800）；采用化學(xué)發(fā)光法檢測患者降鈣素原（PCT）水平（axceed 260）；采用電化學(xué)發(fā)光法檢測患者白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平（cobas e601）；采用免疫熒光法進(jìn)行呼吸道病原體免疫球蛋白M（IgM）抗體聯(lián)合檢測分析呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌（歐盟試劑）；定期采用CPIS（綜合體溫、WBC計數(shù)、氣管分泌物、氧合情況、X線胸片、肺部浸潤影進(jìn)展和氣管吸取物培養(yǎng)來評估感染嚴(yán)重程度的指標(biāo)）對患者肺部感染狀況進(jìn)行量化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Spearman等級相關(guān)系數(shù)對不同檢測指標(biāo)連續(xù)變量與CPIS之間的相關(guān)性做回歸分析，P＜0.05為數(shù)據(jù)間具有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 COVID-19患者入院時的流行病學(xué)史和臨床特征

對4例患者的流行病學(xué)史、初診癥狀和基礎(chǔ)疾病史進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)熱和肺炎是患者的主要癥狀表現(xiàn)；患者病情輕重未表現(xiàn)出年齡和基礎(chǔ)疾病相關(guān)傾向；2例患者感染途徑尚不完全明確，見表1。

表1 COVID-19患者入院時的流行病學(xué)史和臨床特征

2.2 COVID-19患者入院時的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和CPIS

對4例患者入院時的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和CPIS進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，所有患者均行呼吸道標(biāo)本核酸檢測確診，并排除了甲乙型流感、其他病毒或細(xì)菌感染；血液細(xì)胞、血液生化及炎性指標(biāo)均發(fā)生與疾病相關(guān)的水平改變，以LYM總數(shù)、T淋巴細(xì)胞數(shù)、IL-6、CRP和ESR變化最為普遍；1例有腹瀉癥狀的患者糞便樣本新型冠狀病毒核酸檢測呈陽性，見表2。

2.3 動態(tài)監(jiān)測COVID-19患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和臨床肺部感染情況變化

2.3.1 病例1、2、3實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果動態(tài)變化及與CPIS的相關(guān)回歸分析

3例患者在疾病全程均為單一新型冠狀病毒感染，實(shí)驗(yàn)室相關(guān)連續(xù)監(jiān)測指標(biāo)結(jié)果見表3。由于PCT結(jié)果均正常且變化極小，所以將除PCT的其他檢測結(jié)果與CPIS做相關(guān)性分析，結(jié)果見表4；對5個（LYM 總數(shù)、CD3 T、 CD4 T、 CD8 T、CRP）與CPIS具有相關(guān)性的指標(biāo)做回歸分析，均呈曲線相關(guān)，曲線擬合、r2和P見圖1（A、B、C、D、E）。

表2 COVID-19患者入院時的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和CPIS

表3 COVID-19患者白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、炎性指標(biāo)動態(tài)監(jiān)測結(jié)果及CPIS

表4 COVID-19患者動態(tài)監(jiān)測指標(biāo)與CPIS的相關(guān)性

2.3.2 病例4實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果動態(tài)變化及與CPIS的相關(guān)回歸分析

該患者在治療過程中病情突然加重，并合并細(xì)菌感染，實(shí)驗(yàn)室相關(guān)連續(xù)監(jiān)測指標(biāo)及與CPIS的相關(guān)性分析結(jié)果見表5；CRP是研究中唯一與CPIS具有相關(guān)性的指標(biāo)，對CRP與CPIS的相關(guān)性做回歸分析，兩者呈直線相關(guān)，線性擬合、r2和P見圖1（F）。

表5 COVID-19合并細(xì)菌感染患者白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、炎性指標(biāo)動態(tài)監(jiān)測結(jié)果及CPIS

圖1 COVID-19患者LYM總數(shù)（A）、CD3 T（B）、CD4 T（C）、CD8 T（D）、CRP（E、F）與CPIS的相關(guān)回歸分析

3 討論

本研究報道了川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院早期經(jīng)實(shí)驗(yàn)室確診的4例COVID-19病例，其中2例患者感染路徑明確，另2例雖感染路徑尚未完全明確，但兩人均在發(fā)病前到過同一酒店參加婚宴，由于宴會廳相對密閉，通過飛沫或接觸傳播感染的可能性較大。發(fā)熱和肺炎是新型冠狀病毒感染患者的主要臨床表現(xiàn)，但1例腹瀉患者糞便核酸檢測陽性提醒我們需要警惕含有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）的臟器功能改變與新型冠狀病毒感染的關(guān)聯(lián)性[12]，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)注意甄別，以免誤診和漏診[13]。在患者入院檢測數(shù)據(jù)分析中，我們發(fā)現(xiàn)所有患者LYM總數(shù)和總T淋巴細(xì)胞數(shù)減低，淋巴細(xì)胞亞群CD4 T和CD8 T淋巴細(xì)胞數(shù)減低出現(xiàn)在大部分病例中，且病情越嚴(yán)重患者細(xì)胞減低幅度越大，表明新型冠狀病毒感染初期對患者免疫系統(tǒng)及淋巴細(xì)胞的消耗和破壞作用即廣泛存在[14-15]。炎性指標(biāo)IL-6、CRP、ESR升高見于所有患者入院初檢，表明炎性指標(biāo)在新型冠狀病毒感染中發(fā)揮重要的免疫作用；特別是CRP，一般病毒感染性疾病CRP不升高或輕度升高（＜25 mg/L），但在新型冠狀病毒感染患者中CRP顯著升高，為聯(lián)合淋巴細(xì)胞鑒別其他病毒感染性疾病提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[16-17]。2例患者出現(xiàn)低白蛋白血癥，治療措施應(yīng)包含營養(yǎng)支持方案；1例患者在疾病早期出現(xiàn)心肌酶譜檢測異常，提醒我們應(yīng)注意新型冠狀病毒對心臟的攻擊和損傷，做好早期防范工作。

在進(jìn)一步的研究中，我們連續(xù)監(jiān)測了白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和炎性指標(biāo)，研究表明，3例單一新型冠狀病毒感染患者的 LYM 總數(shù)及 CD3 T、CD4 T、CD8 T 淋巴細(xì)胞數(shù)與CPIS負(fù)相關(guān)，而CRP水平與CPIS正相關(guān)，表明這些指標(biāo)的變化與患者肺部感染的病情進(jìn)展有良好的相關(guān)性，在有條件的醫(yī)療機(jī)構(gòu)推薦對患者T淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式計數(shù)常規(guī)監(jiān)測；而在基層醫(yī)院，監(jiān)測LYM總數(shù)+CRP的適用范圍更廣。在動態(tài)監(jiān)測中未發(fā)現(xiàn)IL-6與CPIS有相關(guān)性，可能原因是IL-6對機(jī)體炎癥消退呈現(xiàn)高敏感性，在患者其他臨床指標(biāo)并未恢復(fù)前IL-6即顯著降低，從另一角度表明了IL-6對患者預(yù)后的提示作用早于CRP，可供臨床在疾病診治中靈活使用[18]。3例患者在治療全程PCT水平均正常，有利于排除患者合并細(xì)菌感染的情況。ESR雖在疾病發(fā)生時升高，但由于其受機(jī)體內(nèi)環(huán)境因素的影響多，所以在疾病監(jiān)測中臨床意義不大。病例4在入院2 d后病情加重，合并細(xì)菌感染，導(dǎo)致表征疾病的指標(biāo)在動態(tài)監(jiān)測中變化更加復(fù)雜，LYM總數(shù)及T淋巴細(xì)胞數(shù)變化不再與CPIS相關(guān)，其原因是病毒合并細(xì)菌感染刺激了機(jī)體更多的免疫細(xì)胞參與抗感染過程，包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等，單一種群的細(xì)胞已無法很好地評估臨床疾病狀況[19]；同時，病例4的IL-6和PCT水平隨病情變化更快、幅度更大，雖然與CPIS評分在統(tǒng)計學(xué)上無相關(guān)性，但兩者隨疾病變化的趨勢顯著，特別是在患者第5天的檢測中，IL-6和PCT水平顯著升高，提示醫(yī)務(wù)人員給予了患者緊急治療，從第7～9天，兩項(xiàng)指標(biāo)水平逐漸下降，效果明顯，總之，IL-6和PCT水平對臨床及時制定抗感染、控制炎性指標(biāo)風(fēng)暴的治療方案起到了重要的作用；在病例4中，CRP是僅有的與CPIS具有相關(guān)性的指標(biāo)，且呈直線相關(guān)，表明其與臨床肺部感染狀況存在密切的關(guān)系，在抗感染監(jiān)測中可發(fā)揮重要的作用。

綜上所述，不同的細(xì)胞及炎性指標(biāo)在COVID-19患者治療監(jiān)測中發(fā)揮了不同的作用，臨床需選擇不同的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)用于單一新型冠狀病毒感染與病毒合并細(xì)菌感染患者抗肺部感染的療效評估；而新型冠狀病毒感染患者CRP的升高不僅與其他病毒感染患者存在區(qū)別，而且是本研究發(fā)現(xiàn)的唯一與不同病情新型冠狀病毒感染患者CPIS均具有相關(guān)性的指標(biāo)，建議將其作為鑒別診斷和病情監(jiān)測的關(guān)鍵指標(biāo)應(yīng)用于臨床。