基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的金振口服液干預(yù)新冠肺炎的機(jī)制研究

蔡孟成，俞超芹 （海軍軍醫(yī)大學(xué)：.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, .中醫(yī)系，上海 200433）

2019年12月，湖北省武漢市爆發(fā)新型冠狀病毒肺炎（簡稱“新冠肺炎”，coronavirus disease 2019，COVID-19），由于新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）傳染力強(qiáng)、傳播范圍廣，我國將新冠肺炎定義為急性呼吸道傳染病并按甲類傳染病進(jìn)行管理。有效的管控措施使得目前國內(nèi)疫情得到了一定控制，但中、重癥患者的治療情勢依然嚴(yán)峻復(fù)雜[1-2]。

金振口服液由羚羊角、平貝母、大黃、黃芩、牛黃、青礞石、生石膏、甘草八味中藥構(gòu)成，具有清熱解毒，祛痰止咳的功效，主要用于急性支氣管炎符合痰熱咳嗽者，表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳吐黃痰；現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金振口服液中含有蘆薈大黃素、大黃酚、黃芩素等成分[3-4]。目前，金振口服液已經(jīng)成為援助一線的重要物資[5]。此外，在第四期中國新冠疫情防控經(jīng)驗(yàn)國際分享交流會上，鐘南山院士指出金振口服液具有較好的體外抗病毒與抗炎活性，其 TC50值為 29.44 mg/ml，EC50值為 5.85 mg/ml，SI值為5.03。本文旨在通過對金振口服液進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，以期明確其物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的作用機(jī)制，為抗疫貢獻(xiàn)一份力量。

1 材料與方法

1.1 藥物靶點(diǎn)篩選

本研究采用計算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP) (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索中藥羚羊角、平貝母、大黃、黃芩、牛黃、青礞石、生石膏、甘草的活性成分。因石膏、青礞石和羚羊角作為礦物類和動物類藥材的特殊性，故本文方法暫時未將其納入分析范圍[6]。根據(jù)化合物口服生物利用度(OB)與類藥性(DL)進(jìn)行篩選，OB閾值設(shè)為OB≥30%，DL閾值設(shè)為DL≥0.18，最終篩選出154個化合物，入血化合物141個并采用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得對應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)的收集

以 novel coronavirus pneumonia 為關(guān)鍵詞檢索GeneCard（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫，收集與新冠肺炎相關(guān)的作用靶點(diǎn)。

1.3 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

為明確疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)之間的關(guān)系，將兩部分靶點(diǎn)進(jìn)行交集，輸入Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建出化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape軟件的核心架構(gòu)是網(wǎng)絡(luò)，每個節(jié)點(diǎn)是基因或分子，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接代表這些生物分子之間的相互作用，節(jié)點(diǎn)的度值代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)相連的數(shù)目。

1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

為更深層次探究靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將交集所得的共同靶點(diǎn)上傳至線上軟件STRING10.5(http://string db.org)，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。物種選擇為Homosapiens，參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 生物過程與通路分析

利用 R Project中的 org.Hs.eg.db程序包(HYPERLINK http://www.bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html)將基因 symbols轉(zhuǎn)變?yōu)?Entrez IDs，進(jìn)而利用clusterProfiler程序包 (3.6版)(HYPERLINK http://bioconductor.org/packages http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html）對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO分析和KEGG通路分析。設(shè)定P＜0.05，并按照涉及的靶點(diǎn)數(shù)目多少進(jìn)行排序，獲取GO富集分析中分子功能、細(xì)胞組成和生物過程的前15個條目以及KEGG富集的前20條信號通路。

2 結(jié)果

2.1 篩選藥物活性成分

通過TCMSP檢索到平貝母、大黃、黃芩、牛黃、甘草中化合物共580種：其中46個來自平貝母，92個來自大黃，143個來自黃芩，19個來自牛黃，280個來自甘草。以O(shè)B≥30%且DL≥0.18篩選出化合物158種：其中9個來自平貝母，16個來自大黃，36個來自黃芩，5個來自牛黃，92個來自甘草。入血成分144種：7個來自平貝母，10個來自大黃，32個來自黃芩，5個來自牛黃，90個來自甘草。其中，β-谷甾醇為平貝母、黃芩、甘草的共有成分。部分化合物見表1。

表 1 金振口服液部分活性成分

(續(xù)表 1)

2.2 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape3.6.1軟件構(gòu)建的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包含140個化合物節(jié)點(diǎn)、47個靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和483條邊，用紫色節(jié)點(diǎn)表示甘草中的化合物，深綠色節(jié)點(diǎn)表示黃芩中的化合物，橙色節(jié)點(diǎn)表示大黃中的化合物，紅色節(jié)點(diǎn)表示平貝母中的化合物，黃色節(jié)點(diǎn)表示共有化合物，淺綠色節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)(圖1)。依據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)可知，有較多節(jié)點(diǎn)的化合物或藥物靶點(diǎn)在整個網(wǎng)絡(luò)中可能起到關(guān)鍵作用，因此，本研究篩選節(jié)點(diǎn)度較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析。表2列出了化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)。排名前5位的化合物分別為槲皮素（quercetin）、漢黃芩素（wogonin）、山奈酚（kaempferol）、柚皮素（naringrnin）、甘草查爾酮 A（licochalcone a）。分別能與38個、13個、13個、11個、9個靶點(diǎn)蛋白發(fā)生作用。從靶點(diǎn)的角度看，度值排名前5位的是前列腺素過氧化物合酶2（PTGS2）、一氧化氮合酶（NOS2）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、前列腺素過氧化物合酶1（PTGS1）、絲裂原活化蛋白激酶 14（MAPK14），分別能與 114個、84個、72個、70個和50個化合物發(fā)生相互作用，體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)的特性。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

應(yīng)用STRING軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)，在此網(wǎng)絡(luò)圖中包含49個節(jié)點(diǎn)，1 186條邊，同時得到網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵靶點(diǎn)的頻次(圖3)。根據(jù)“度值＞均值”篩選出關(guān)鍵節(jié)點(diǎn) 26個，包括：MAPK3、MAPK8、IL6、 CASP3、 IL10、 MAPK1、 CXCL8、 CCL2、IL1B、 PTGS2、 IFNG、 IL4、 FOS、 ICAM1、 IL2、MAPK14、EGFR、RELA、CASP8、CAT、STAT1、BCL2L1、HMOX1、NOS2、PPARG、CXCL10。度值最高的是MAPK3和MAPK8，度值為40；其次為IL-6，度值為39；CASP3度值為38。度值大的靶點(diǎn)提示在網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，度值大的靶點(diǎn)很可能是金振口服液治療NCP的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖 1 金振口服液主要成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表 2 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)及其拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)

2.4 GO 富集與 KEGG 富集分析

GO生物過程條目（圖4）主要包括：對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、細(xì)胞內(nèi)脂多糖反應(yīng)（cellular response to lipopolysaccharide）、氧化應(yīng)激反應(yīng)（response to oxidative stress）、對機(jī)械刺激的反應(yīng)（response to mechanical stimulus）以及外源性凋亡信號通路（extrinsic apoptotic signaling pathway）等；分子功能包括：細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、受體-配體活性（receptor ligand activity）、趨化因子受體結(jié)合（chemokine receptor binding）以及趨化因子活性（chemokine activity）；并且參與了膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、膜區(qū)（membrane region）結(jié)構(gòu)的組成。KEGG富集信號通路（圖5，圖6）主要包括：AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic）、 IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、甲型流感信號通路（Influenza A）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、南美錐蟲病信號通路（Chagas disease）等。

圖 2 金振口服液靶點(diǎn)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)

圖 3 PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)

圖 4 金振口服液抗新冠肺炎 GO 富集分析

圖 5 金振口服液抗新冠肺炎KEGG富集分析柱狀圖

3 討論

在這場防治疫情保衛(wèi)戰(zhàn)中，中醫(yī)藥發(fā)揮了積極作用，大量中藥方劑已經(jīng)應(yīng)用于臨床并顯示出其明確的療效[7-8]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為新冠肺炎屬于疫病的范疇。病因是濕熱戾氣，病機(jī)是由于濕熱戾氣從口鼻而入，首先犯肺，使肺的宣發(fā)肅降功能失常，從而出現(xiàn)咳嗽；因?yàn)樾皻庑再|(zhì)濕熱，濕邪易阻遏氣機(jī)損傷陽氣，熱邪易傷津耗氣，故而患者會出現(xiàn)乏力、發(fā)熱的表現(xiàn)[9-10]。隨著疾病逐漸發(fā)展，邪氣按衛(wèi)氣營血的規(guī)律傳變?nèi)肜?，最終逆?zhèn)餍陌?，出現(xiàn)神昏譫語等危重證候。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為新冠肺炎是由SARS-CoV-2導(dǎo)致的，故而抗病毒是治療新冠肺炎的重要舉措，臨床研究證實(shí)，金振口服液可以治療呼吸道合胞病毒、嚴(yán)重呼吸窘迫綜合征冠狀病毒、柯薩奇病毒等引起的上呼吸道感染[11-13]，但物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)金振口服液抗炎的活性物質(zhì)主要為黃酮類化合物，包括槲皮素、漢黃芩素、山奈酚、柚皮素、甘草查爾酮A等?，F(xiàn)代研究表明：槲皮素可與病毒表面蛋白相互作用阻斷病毒的黏附[14]；漢黃芩素可以通過抑制病毒基因復(fù)制和蛋白合成抑制病毒增殖[15]；柚皮素可以抑制神經(jīng)氨酸酶活性與血凝素活性發(fā)揮抗病毒的作用[16]。KEGG富集分析結(jié)果表明，金振口服液抗SARSCoV-2的機(jī)制可能是通過作用于甲型流感病毒信號通路中PKC、ERK、STAT1等靶點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的（圖7）。

基于目前的臨床調(diào)查，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為新冠肺炎可以通過自身的免疫應(yīng)答導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞短時間內(nèi)分泌大量的炎性細(xì)胞因子，這些炎性細(xì)胞因子會使得炎癥細(xì)胞大量滲入肺部，引起免疫激化。新冠肺炎的嚴(yán)重程度與機(jī)體炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度相關(guān)，隨著疾病發(fā)展，如果患者體內(nèi)出現(xiàn)過度的炎癥反應(yīng)，即細(xì)胞因子風(fēng)暴，將可能導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞大量凋亡，最終引起急性肺損傷與呼吸窘迫綜合征等危重證候[17-19]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素來控制細(xì)胞因子風(fēng)暴，但糖皮質(zhì)激素的副作用使得抗疫陷入進(jìn)退兩難的境地。中藥在抗炎作用上具有明顯優(yōu)勢，在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，發(fā)揮整體調(diào)節(jié)的優(yōu)勢，并根據(jù)藥物配伍減毒增效，是目前治療新冠肺炎的重要手段。PPI結(jié)果表明：金振口服液中的活性物質(zhì)主要作用于炎性介質(zhì)，其可能是通過降低白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子等炎癥因子的分泌水平，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化等發(fā)揮抗炎作用[20-21]。現(xiàn)代研究表明：槲皮素具有抑制炎癥反應(yīng)、抗呼吸道感染的作用[22-23]；漢黃芩素具有抗氧化活性、抗炎等作用[24]；山奈酚可以通過抑制肺組織促炎因子減輕脂多糖導(dǎo)致的小鼠急性肺損傷[25]。KEGG富集分析結(jié)果表明其抗炎機(jī)制可能是通過作用于IL-17信號通路和TNF信號通路實(shí)現(xiàn)的（圖8、圖9）。實(shí)驗(yàn)研究表明：金振口服液可以通過抑制p65、NF-κB、ERK1/2、p38多個靶蛋白磷酸化，從而阻斷核轉(zhuǎn)錄因子-κB，絲裂原活化蛋白激酶炎癥通路，降低炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而改善急性肺損傷[26-27]，證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果。

圖 6 金振口服液抗新冠肺炎KEGG富集分析氣泡圖

圖 7 甲型流感信號通路

綜上所述，金振口服液治療新冠肺炎的有效成分可能是槲皮素、漢黃芩素、山奈酚、柚皮素、甘草查爾酮A等，這些成分通過炎癥相關(guān)靶點(diǎn)參與IL-17、TNF、甲型流感等信號通路，從而發(fā)揮抗病毒、抗炎的作用。因此，在金振口服液的生產(chǎn)和質(zhì)量控制過程中，應(yīng)當(dāng)重視槲皮素、漢黃芩素等主要活性物質(zhì)。此外，由于石膏、青礞石和羚羊角作為礦物類和動物類藥材的特殊性，筆者未能在數(shù)據(jù)庫中獲取其活性成分，故在本研究結(jié)論中未能體現(xiàn)其作用。但中醫(yī)學(xué)認(rèn)為生石膏辛甘大寒可解肌退熱；青礞石咸平可墜痰下氣；羚羊角咸寒可散血解毒，三者合用共奏清熱止咳、宣肺滌痰之功。臨床上應(yīng)用的銀翹白虎湯、礞石滾痰丸、羚羊角顆粒在退熱、止咳方面療效顯著[28-30]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：石膏具有一定的抗炎效應(yīng)，可能是通過抑制TLR4/NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的[31]；青礞石可以通過抑制海馬內(nèi)膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達(dá)發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用[32]；羚羊角可降低炎癥因子如前列腺素、白細(xì)胞介素等的表達(dá)起到解熱作用[33]。因此，對于礦石藥以及動物藥的活性成分及作用機(jī)制也應(yīng)深入研究，以期為傳統(tǒng)中藥的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)；同時，藥物活性成分在炮制過程中改變、中藥活性成分含量不確定等因素，使得本研究結(jié)果可能與臨床效果存在一定偏差。但是，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究結(jié)果也可為中醫(yī)藥治療新冠肺炎提供一定的理論基礎(chǔ)，為臨床上用藥選擇提供一定依據(jù)。

圖 8 IL-17 信號通路

圖 9 TNF 信號通路

致謝

感謝金永生老師在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和活性化合物收集等方面給予的技術(shù)支持。