木素脫氫聚合物-葡萄糖復(fù)合體形成機理的研究

謝益民 蔣 晨 劉雁超

（1.湖北工業(yè)大學(xué)制漿造紙研究院，湖北武漢，430068；2.湖北工業(yè)大學(xué)綠色輕工材料湖北省重點實驗室，湖北武漢，430068）

在制漿造紙工業(yè)、黏膠纖維工業(yè)[1-2]以及生物精煉過程中，需要最大限度從植物細胞壁中分離出纖維素，提高植物原料的利用率。大量研究[3-4]證實了植物體內(nèi)木素與碳水化合物（纖維素和半纖維素）之間是有化學(xué)鍵連接的，主要與半纖維素間有大量的鍵結(jié)合，也有部分與纖維素連接，一般認為木素-碳水化合物復(fù)合體（LCC）之間的連接鍵為：苯甲醚鍵、糖醛酸苯甲酯鍵、苯基糖苷鍵、木素側(cè)鏈上的糖苷鍵和縮醛鍵等。而聚葡萄糖-木素復(fù)合體[5-8]的存在嚴重阻礙了制漿過程中木素的完全脫除，影響了紙漿的得率以及紙漿在深度脫木素過程中的效率[9-13]。因此聚葡萄糖-木素復(fù)合體中化學(xué)結(jié)構(gòu)的解析及其降解特性的研究是制漿造紙領(lǐng)域和木材化學(xué)一個重要的研究方向。

20世紀90年代，Karlsson等人[5]利用色譜的方法確認了松木硫酸鹽漿里有非常牢固的木素-纖維素化學(xué)鍵。Isogai A[14]在研究高純度黏膠纖維時發(fā)現(xiàn)，反復(fù)的精制處理也不能獲得純的纖維素，通常伴隨著甘露糖、木糖等半纖維素組分，也含有木素組分，認為木素有可能與纖維素的C6之間存在化學(xué)鍵的連接。部分研究者[15-17]認為，比較無序的纖維素無定形區(qū)可能與木素有化學(xué)鍵的結(jié)合。Oinonen P 等人[18]的研究小組對纖維素-木素復(fù)合體做了大量的研究，認為纖維素微細纖維束及由木素和半纖維素構(gòu)成的matrix 之間的界面上，存在木素側(cè)鏈Cα和纖維素之間的共價鍵的連接。Zhou Y 等人[19]使用天然豐度穩(wěn)定同位素比值（18O/16O 比值）分析植物細胞壁纖維素和木素之間的化學(xué)鍵，提出了一個更詳細的纖維素-木素復(fù)合體模型，認為木素和纖維素之間存在γ-酯鍵和α-醚鍵的連接。也有研究者[20-21]提出纖維素和木素之間的連接鍵除了上述兩種外，還有可能存在苯基糖苷鍵。

為了更直觀研究纖維素和木素之間的化學(xué)連接，研究人員對植物體外合成木素-碳水化合物模型物進行了大量探索[22-23]。Freudenberg 等人[24-25]通過在濃厚的蔗糖溶液中滴加松柏醇及木素氧化酶，證實了松柏醇脫氫聚合反應(yīng)中有木素-碳水化合物復(fù)合體形成的可能性。蘇琪等人[26]研究了在微晶纖維素存在下，木素脫氫聚合物-纖維素復(fù)合物（DHPCC）的生物合成，發(fā)現(xiàn)在二氯乙烷-乙醇混合液和8 mol/L 尿素溶液的溶解處理下，也不能完全去除DHP 部分，得出在木素脫氫聚合物形成的過程中能與纖維素產(chǎn)生牢固化學(xué)鍵連接的結(jié)果。顧瑞軍等人[27]合成了側(cè)鏈α位帶13C標記的木素前驅(qū)物松柏醇-β-D-葡萄糖苷，模擬木素生物合成過程，得到帶13C 標記的DHP-綜纖維素復(fù)合物（DHPHC），研究發(fā)現(xiàn)木素苯丙烷結(jié)構(gòu)單元的Cα與碳水化合物間的化學(xué)連接鍵主要是醚鍵和酯鍵?？傊?，大量研究已經(jīng)證實植物原料中碳水化合物和木素間存在化學(xué)鍵的連接，但是聚葡萄糖-木素間化學(xué)鍵的證據(jù)依然不足，仍需進一步探討。

本研究首先探討了在C6位帶13C 同位素標記的（6-13C）葡萄糖存在下，松柏醇葡萄糖苷利用過氧化物酶的催化作用，合成DHP-（6-13C）葡萄糖的聚合物，采用13C NMR 分析木素側(cè)鏈與葡萄糖C6位之間連接鍵的形成。在此基礎(chǔ)上，進一步分析在纖維二糖的存在下，松柏醇葡萄糖苷的過氧化物酶催化脫氫聚合，得到了DHP-纖維二糖復(fù)合體，通過13C NMR 分析纖維二糖與DHP 之間化學(xué)鍵的連接，從而進一步驗證聚葡萄糖與木素之間的連接方式。

1 實 驗

1.1 試劑及儀器

松柏醇-β-D-葡萄糖苷（實驗室合成）；葡萄糖氧化酶（15500 units/g，Ⅱ型，來自黑曲霉，購自美國Sigma 公司）；β-葡萄糖甙酶（6.3 U/mg,來自杏仁，購自美國Fluka 公司）；過氧化物酶（158 purpurogallin units/mg，Ⅱ型，來自辣根，購自美國Sigma 公司）；葡萄糖、乙酸鈉、乙酸、無水乙醚等均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

松柏醇-β-D-葡萄糖苷溶液的配制：500 mg 松柏醇-β-D-葡萄糖苷溶解在50 mL 的0.2 mol/L 乙酸/乙酸鈉的緩沖溶液（pH值=4.9），適當?shù)募訜崛芙?，冷卻并用0.45 μm的微孔濾膜過濾，放置常溫備用。

Avance-400 傅里葉超導(dǎo)核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；K-16 大容量冷凍式離心機（美國Sigma 公司）；6700 型傅里葉紅外光譜儀（FT-IR，美國Thermofisher Nicolet 公司）；DIF-6020 型真空干燥箱（上海精密實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 DHP-葡萄糖復(fù)合體的制備

采用顧瑞軍等人[27]改進的方法合成DHP-葡萄糖復(fù)合體，具體步驟為：將1.32 g 葡萄糖溶解在50 mL 0.2 mol/L 乙酸/乙酸鈉的緩沖溶液（pH 值=4.9）中，密封存放。在無菌條件下，將葡萄糖氧化酶50.0 mg、β-葡萄糖甙酶44.1 mg、過氧化物酶1.5 mg溶解在3 mL 新鮮的蒸餾水中，溶解好后加入到葡萄糖的緩沖溶液中。在曝氣條件下，用恒流泵將500 mg 松柏醇葡萄糖苷溶液在24 h 內(nèi)逐滴加入到酶與葡萄糖的混合溶液中，滴加完畢后，在30℃的恒溫水浴鍋中繼續(xù)反應(yīng)10 天，且在反應(yīng)期間不斷地通入經(jīng)過棉花和活性炭過濾后的空氣。反應(yīng)結(jié)束后離心分離，用水洗滌不溶物8次，真空干燥后再用無水乙醚清洗3次，真空干燥后得100.3 mg未標記的木素脫氫聚合物-葡萄糖復(fù)合物（DHP-葡萄糖復(fù)合體）。

取500 mg 松柏醇葡萄糖苷、100 mg (6-13C)葡萄糖，用上述方法合成96 mg 帶標記的復(fù)合物（DHP-(6-13C)葡萄糖復(fù)合體）。

1.3 DHP-纖維二糖復(fù)合體的制備

參考合成DHP-葡萄糖復(fù)合體的方法[27]，將2.5 g纖維二糖溶解在50 mL 0.2 mol/L 乙酸/乙酸鈉的緩沖溶液（pH 值=4.9）中。在無菌條件下，將葡萄糖氧化酶50.0 mg、β-葡萄糖甙酶44.1 mg、過氧化物酶1.5 mg 溶解在3 mL 新鮮的蒸餾水中，溶解好后加入到纖維二糖的緩沖溶液中。在曝氣條件下，用恒流泵將500 mg 松柏醇葡萄糖苷溶液在24 h 內(nèi)逐滴加入到酶與纖維二糖的混合溶液中，滴加完畢后，在30℃的恒溫水浴鍋中繼續(xù)反應(yīng)10 天，且在反應(yīng)期間不斷地通入經(jīng)過棉花和活性炭過濾的空氣。反應(yīng)結(jié)束后離心分離，用水洗滌不溶物8 次，真空干燥后得80 mg 木素脫氫聚合物-纖維素二糖復(fù)合物。

1.4 紅外光譜表征

取約2 mg 樣品與10 倍量的無水KBr 混合，混合均勻后，倒入壓片模具中壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀用透過法測定紅外光譜圖。

1.5 液態(tài)13C NMR譜圖的測定

液態(tài)13C NMR 譜圖采用華中科技大學(xué)的Bruker AV400 型核磁共振儀進行測定。將約100 mg 樣品溶于0.6 mL DMSO-d6中，用φ5 mm 樣品管。實驗條件：掃描頻率100 MHz，25℃，脈沖信號30°，延遲時間3 s，掃描次數(shù)20000次。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖1 為DHP-葡萄糖復(fù)合體和DHP-(6-13C)葡萄糖復(fù)合體的紅外光譜圖。從圖1 可以看出，3427.3、3428.2 cm-1處的吸收峰為羥基的吸收峰。在1602.0、1510.4 cm-1及1413.3 cm-1處的吸收峰說明了該產(chǎn)物中有苯環(huán)結(jié)構(gòu)存在[28]，由此可知產(chǎn)物中有木素結(jié)構(gòu)。1035.8、1082.4 cm-1的吸收峰為葡萄糖結(jié)構(gòu)上C—O鍵的伸縮振動[11]，說明聚合物中含有一定量的聚葡萄糖。由以上的分析可以推斷出葡萄糖與木素之間確實有化學(xué)鍵連接。要深入了解DHP 與葡萄糖之間具體的化學(xué)連接方式，還需要通過13C NMR 進行進一步分析。

圖1 DHP-葡萄糖復(fù)合體和DHP-(6-13C)葡萄糖復(fù)合體的FT-IR圖

2.2 高分辨率液態(tài)13C NMR分析

圖2 DHP-葡萄糖復(fù)合體和DHP-(6-13C)葡萄糖復(fù)合體的13C NMR譜圖

圖2 為DHP-葡萄糖復(fù)合體和DHP-(6-13C)葡萄糖復(fù)合體的13C NMR 譜圖。根據(jù)前人對木素的13C NMR譜圖的分析結(jié)果[29-32]，本研究對圖2 中的共振信號進行了歸屬，結(jié)果見表1。分析得到的木素結(jié)構(gòu)單元間連接方式如圖3 所示。以δ=56.04 處甲氧基的共振峰作為基準，由分析可知δ為176.65 (No.1)、174.89(No.2)處均為阿魏酸及其衍生物的羰基的共振信號(結(jié)構(gòu)見圖3(Ⅰ)、圖3(Ⅱ))。δ=147.58(No.3)是醚化的愈創(chuàng)木基中的C3，δ=144.12 (No.5)處是醚化的5-5’結(jié)構(gòu)(見圖3(Ⅳ))中的C4/C4’，δ=132.26(No.6)處為愈創(chuàng)木基中的C1，δ為129.70(No.8)和128.44(No.9)處均為松柏醇結(jié)構(gòu)中的Cα和Cβ(見圖3(Ⅰ))上的振動信號，δ為119.40(No.10)～110.22(No.12)處分別為愈創(chuàng)木基中C6、C5、C2上的振動峰，上述吸收峰的強度都比較高，說明了DHP-葡萄糖復(fù)合體中芳香族結(jié)構(gòu)所占的比例比較高。δ為100.34 (No.13)處為葡萄糖上的C1的振動峰，δ為87.53 (No.15)處的信號峰為β-5 結(jié)構(gòu)(見圖3(Ⅵ))中的Cα和Cβ的共振吸收峰。δ為85.50(No.16)處是β-β結(jié)構(gòu)(見圖3(Ⅶ))中Cα的吸收峰。δ為71.12 (No.21)處是葡萄糖上C2的振動峰，δ為73.58(No.18)處為葡萄糖上C3的振動吸收峰，δ為70.17(No.22)處為葡萄糖上C4的振動峰，δ為71.91(No.20)處為葡萄糖上C5的振動峰，δ為61.99(No.24)處為葡萄糖C6的峰，DHP-(6-13C)葡萄糖復(fù)合體較DHP-葡萄糖復(fù)合體有很明顯的增強，說明復(fù)合體中的葡萄糖C6被13C 同位素標記，此處還有愈創(chuàng)木基β-O-4 結(jié)構(gòu)(見圖3(Ⅲ))中Cγ的峰。δ為72.70 (No.19)處的吸收峰，兩種復(fù)合體譜圖相比較可發(fā)現(xiàn)DHP-(6-13C) 葡萄糖復(fù)合體峰有明顯的增強。根據(jù)Azuma J 等人[33]對纖維素及其相關(guān)碳水化合物的核磁研究表明纖維素C6位上的碳有醚鍵存在時，纖維素C6峰的化學(xué)位移向低場遷移到δ為72.6。根據(jù)Xie Y 等人[34]的研究結(jié)果，木質(zhì)素苯丙烷結(jié)構(gòu)上只有Cα上才有醚鍵型LCC 連接鍵的存在，由此可知，δ為72.70處的峰為與β-O-4結(jié)構(gòu)中Cα有醚鍵連接的纖維素C6位上的碳原子的共振信號。該結(jié)果與向松明等人[22-23]對銀杏中的纖維素的13C同位素示蹤所得到的結(jié)果一致(見圖3(Ⅴ))。

表1 DHP-葡萄糖復(fù)合體和DHP-(6-13C)葡萄糖復(fù)合體的13C NMR 分析

由DHP 和葡萄糖的過氧化物酶催化聚合實驗以及13C NMR的結(jié)果分析可知，DHP-葡萄糖復(fù)合體中存在的木素結(jié)構(gòu)包括β-β、β-O-4 和β-5，同時還包含少部分的阿魏酸結(jié)構(gòu)。通過帶13C 標記的葡萄糖與DHP聚合，得到的聚合物DHP-(6-13C)葡萄糖復(fù)合體的13C NMR 與不帶同位素標記的DHP-葡萄糖復(fù)合體對比分析可知，葡萄糖C6上的碳與木素結(jié)構(gòu)是以苯甲醚鍵連接的。

2.3 纖維二糖存在下DHP 的生物合成產(chǎn)物紅外光譜分析

纖維二糖存在下DHP 的生物合成產(chǎn)物（DHP-纖維二糖）的FT-IR 譜圖如圖4 所示?？梢钥闯?442.63 cm-1為羥基的伸縮振動峰，2892.71 cm-1為甲基、亞甲基及次甲基中C—H 鍵的伸縮振動，1652.92 cm-1為共軛羰基的伸縮振動，1515.75 及1438.35 cm-1處的吸收峰說明了該產(chǎn)物中有苯環(huán)結(jié)構(gòu)存在，由此可知產(chǎn)物中有木素結(jié)構(gòu)存在。1459.17 cm-1為甲基中C—H 鍵的伸縮振動峰，1384.91 cm-1為芳香核（—OH）振動，1269.24 cm-1為羥基振動和木素中C=O 伸縮振動，1142.48 cm-1為纖維素中羥基的締合光帶，1033.95 cm-1為纖維素中C—O 的伸縮振動，說明有纖維素的存在，至于纖維二糖與木素具體的化學(xué)鍵連接方式，還需要用高分辨率的液態(tài)核磁來對產(chǎn)物進行檢測分析。

2.4 DHP-纖維二糖復(fù)合體的13C NMR波譜分析

為了進一步驗證植物體內(nèi)纖維素C6位與木素側(cè)鏈Cα之間的醚鍵連接[22-23]，本實驗采用DHP 與纖維二糖聚合形成DHP-纖維二糖復(fù)合體，其13C NMR 如圖5所示，具體的核磁共振信號的分析結(jié)果見表2。δ為194.82(No.1)為松柏醛結(jié)構(gòu)中的γ-CHO 的共振吸收峰，δ為172.54No.2)是DHP里阿魏酸的Cγ的振動峰，δ為149.84(No.3)、148.02(No.4)為愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)中碳的吸收峰，δ為144.15 (No.5)是醚化了的5-5 結(jié)構(gòu)中C4的吸收峰。δ為132.81(No.6)是愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)中與丙烷結(jié)構(gòu)相連接的C1的共振信號。δ為129.50(No.7)和128.48(No.8)分別為松柏醇結(jié)構(gòu)中的Cα和Cβ上的振動信號，δ為119.09(No.9)～110.89(No.11)分別為愈創(chuàng)木基中C6、C5、C2上的振動峰，上述吸收峰的強度均比較高，說明了DHP-纖維二糖復(fù)合體中有大量的芳香族結(jié)構(gòu)存在。δ為100.82(No.12)處的信號峰是纖維二糖C1的峰，δ為87.69(No.13)處的信號峰為β-5 結(jié)構(gòu)中的Cα共振峰。δ為85.68(No.14)是β-O-4中 的Cβ以及β-β結(jié)構(gòu)中Cα的信號，δ為81.55(No.14’)處微弱的信號來自于木素結(jié)構(gòu)單元與糖類有苯甲醚鍵相連接的Cα[34-35]。δ為72.11～74.56(No.16)的信號歸屬如下：與纖維二糖上的C2以及與纖維二糖有苯甲酯鍵連接的木素結(jié)構(gòu)單元的]，與β-O-4 結(jié)構(gòu)中Cα有醚鍵連接的纖維素6 位上的碳原子的共振信號[22-23]，以及β-O-4 中Cα，纖維二糖上的C2的信號。δ為70.13(No.17)為纖維二糖上的C4的信號峰。δ為63.43（No.18）處的信號來自苯基香豆?jié)M的Cγ，β-1 結(jié)構(gòu)中Cα與Cβ。δ為62.12(No.19)處除了有纖維二糖上C6的振動峰以外，還有β-O-4 結(jié)構(gòu)中Cγ的共振吸收峰。

圖3 DHP-葡萄糖復(fù)合體中愈創(chuàng)木基的結(jié)構(gòu)單元及與葡萄糖的連接

圖4 DHP-纖維二糖復(fù)合體的FT-IR譜圖

圖5 DHP-纖維二糖復(fù)合體的13C NMR譜圖

由以上的分析結(jié)果可以知道，DHP-纖維二糖復(fù)合體中木素的結(jié)構(gòu)單元之間主要有β-β、β-O-4、β-5以及β-1 等連接方式。DHP 與纖維二糖之間存在苯甲醚鍵、苯甲酯鍵和縮醛鍵相連接，至于具體的纖維二糖上的哪個碳原子與DHP 的哪個碳原子以何種方式連接，還需要進一步采用同位素示蹤等方法闡明。

表2 DHP-纖維二糖復(fù)合體的13C NMR分析

3 結(jié)論

本研究分別在葡萄糖和C6位帶13C同位素（6-13C）葡萄糖的存在下，以松柏醇葡萄糖苷為木素前驅(qū)物，采用木素過氧化物酶催化脫氫聚合的方法，分別形成了木素脫氫聚合物-葡萄糖和木素脫氫聚合物-(6-13C)葡萄糖的聚合物，研究了木素脫氫聚合物（DHP）與葡萄糖的化學(xué)鍵連接方式。

3.1 通過傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、核磁共振碳譜（13C NMR）分析及DHP-葡萄糖和DHP-(6-13C)葡萄糖的波譜圖對比可知，葡萄糖上的C6與木素結(jié)構(gòu)以苯甲醚鍵連接。

3.2 在纖維二糖的存在下，以松柏醇葡萄糖苷為木素前驅(qū)物，采用生物法合成脫氫聚合物的過程中，木素前驅(qū)物與纖維二糖之間發(fā)生了共聚，得到了DHP-纖維二糖的復(fù)合體，通過FT-IR 以及13C NMR 分析結(jié)果得知，纖維二糖與DHP 之間有化學(xué)鍵的連接，可能通過苯甲醚鍵、苯甲酯鍵和α-縮醛鍵相連接。