基于重測序技術篩選工作犬OR 基因SNP 位點

高一龍 賀星亮 溫 海 宋珍華 秦海斌 包喜軍 李 剛 孫 勇

鑒于犬的嗅覺能力突出，各國警方廣泛應用訓練有素的工作犬搜查爆炸物、毒品等違禁品打擊和預防犯罪。工作犬的嗅探能力從根本上講是受犬嗅覺受體(Olfactory receptor，OR)基因調(diào)控的，因此如果能夠運用分子生物學技術開展工作犬嗅探能力與OR 基因之間的關聯(lián)性研究工作，發(fā)現(xiàn)主要的分子標記來挑選嗅覺靈敏的受訓犬，可以顯著提高工作犬的訓成率。目前科研人員對犬OR 基因的研究主要集中在基因組成結構、分類分布和多態(tài)性等方面，很少有人對犬OR 基因多態(tài)性與嗅探能力之間的關聯(lián)性進行研究。

在本研究工作中，以警用工作犬種(德國牧羊犬、拉布拉多犬和史賓格犬)作為模型動物，擬從犬的嗅覺受體基因組中選擇10 個OR 功能基因作為候選基因，測序比對分析研究犬嗅覺受體(OR)基因的多態(tài)性， 為下一步篩選工作犬OR 基因的主效SNP 位點奠定基礎。

一、材料

（一）試驗動物

某警犬基地培訓的工作犬99 頭，其中史賓格犬43頭（公23 頭，母20 頭）、拉布拉多犬39 頭（公24 頭，母15 頭）和德國牧羊犬17 頭（公10 頭，母7 頭）。這些犬是三代以內(nèi)沒有直接血統(tǒng)關系的，體質健康且經(jīng)過實戰(zhàn)檢驗的嗅探犬。

一犬一舍（4×4m2），犬舍屋頂有隔熱層，獨立的戶外運動場（15×6m2）。采用標準的干燥顆粒飼料（福斯牌犬糧）進行定時定量的飼喂，自由飲水，每日適度散放、運動，定時訓練，全程獸醫(yī)監(jiān)控健康保障。

（二）主要試驗儀器

1.PTC-200 PCR 儀，美國BIO-RAD 公司；2.System electrophoresis Mupid 電泳槽，日本TAKARA 公司；3.Bio-Rad CHEMI DOC 凝膠成像分析系統(tǒng)，美國；4.Centrifuge 5810R 高速低溫冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；5.AstraGene AstraNet 紫外分光光度計，英國；6.ABI 3730XL 型DNA 測序儀，美國Applied Biosystems。

（三）主要試劑

1.血液基因組DNA 提取試劑盒(離心柱型)；2.蛋白酶K；3.Ex Taq DNA 聚合酶；4.FG，3130 POP-7TM Polymer、FG，HI-DI FORMAMIDE 25mL BOTTLE 和FG，BUFFER (10X) WITH EDTA 25ML 等測序所有試劑；5.引物合成。

二、方法

表 1 挑選的OR 基因信息

表 2 PCR 擴增反應體系及PCR 擴增反應條件

（一）血樣采集

由具備資格的操作熟練的獸醫(yī)，對所有試驗犬使用一次性真空EDTA 抗凝采血管頸靜脈采血，每頭2～5mL，送至實驗室-20℃冰箱保存。

（二）犬基因組DNA 提取與檢測

樣本的基因組DNA，使用血液基因組DNA 提取試劑盒自行提取。將提取的DNA 溶液置于-20℃長期保存。取基因組DNA 樣 本2μL， 用AstraGene AstraNet 紫外分光光度計測定其濃度和OD 值，要求合格的DNA 樣品濃度須大于50ng／μL，OD260／OD280 在1.6 ～2.0之間，OD260／OD230 在1.8～2.1之間。

（三）嗅覺受體（OR）基因的篩選

從數(shù)目眾多的犬嗅覺受體超級基因家族中，隨機挑選出10 個具有完整閱讀框（ORF）的犬嗅覺受體基因(cOR)： cOR52AC1、cOR9S13 、c O R 9 Q 13、C f O R 0 5 2 5、C f O R 0 0 1 5、C f O R 0 0 0 4、CfOR0006、CfOR0055、CfOR0149和 CfOR0192，詳見表2。重疊群（contig）和具體序列信息可從 (http://dogs.genouest.org/ORrepertoire.html ) 和NCBI 數(shù)據(jù) 庫 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找獲取。

(四）引物設計

根據(jù)查找到的OR 基因參考序列，設計OR 基因PCR 擴增和測序成對引物的設計，可采用軟件Primer Premier 3.0 進行設計引物。OR 基因引物具體序列和測序引物序列信息略。

（五）聚合酶鏈反應（PCR）、測序和序列分析

1.聚合酶鏈反應（PCR）

采用PTC-200 熱循環(huán)儀進行PCR 反應，30μL 反應體系及反應條件見表4取PCR 產(chǎn)物，用經(jīng)EB 染色的1%瓊脂糖凝膠水平電泳，100mA/cm，120V 電泳1 小時。

2. PCR 產(chǎn)物純化

按照Millipore 公司96 純化板操作流程操作：向96 純化板孔中加入100μL ddH2O，取出PCR 產(chǎn)物至96純化板中室溫靜置10 分鐘，真空抽濾泵10 分鐘抽干，向96 孔純化板中加入40μL ddH2O，室溫溶解10 分鐘，取出對應的孔中的純化產(chǎn)物至另一96 孔PCR 板中。提取純化目的條帶DNA，此步驟對于保證測序的高精確性至關重要。

3.測序

將提純好的目的條帶DNA，交給基因公司測序。

4.序列分析

測序序列，采用Phred 等軟件進行分析。在Linux系統(tǒng)下利用Phred/prap/consed 軟件進行序列的分析和基因頻率的統(tǒng)計。

三、結果與分析

（一）PCR 擴增產(chǎn)物結果

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR 擴增目的產(chǎn)物條帶單一特異性強，DNA 條帶清晰透亮，產(chǎn)物的大小符合預期結果，具體見圖2。

（二）測序結果

圖2 電泳抽檢膠圖

1.測序峰圖

除COR9S13 基因以外，其他9 個OR 基因都能順利測序。而COR9S13 基因由于片段較長（1634bp），且在部分樣本中有1 至多個poly 結構，經(jīng)不斷優(yōu)化實驗條件，最終有50 個樣品經(jīng)3 個測序反應可以測通，各個OR 基因測序圖略。

2.測序分析比對結果

對99 個樣本的10 個OR 基因測序數(shù)據(jù)，分析比對后發(fā)現(xiàn)總共有67 個SNP 位點:

其中CfOR0006 基因有12 個SNP 位點、CfOR0004基因有9 個SNP 位點、CfOR0015 基因有5 個SNP 位點、CfOR0055 基因有8 個SNP 位點、CfOR0149 基因有3 個SNP 位點、CfOR0192 基因有3 個SNP 位點、CfOR0525基因有4 個SNP 位點、COR9S13 基因有8 個SNP 位點、COR52AC1 基因有10 個SNP 位點、OR10H08 基因有5 個SNP 位點。

（三）SNP 最小等位基因頻率（MAF）

NCHROBS：染色體數(shù)目，即樣本數(shù)X2；DM：德牧，LD：拉多，SBG：史賓格，All：所有樣本。

MAF（最小等位基因頻率）是指一個突變位點的最小突變頻率，越大當然越好，通常認為一個位點的MAF＞0.05 才有研究的意義，如果滿足不了0.05 的話，說明這個位點的突變頻率很低，那么除非實驗的標本量很大有好幾千，否則做實驗過程中很有可能無法做出突變基因。通過MAF 計算標本量，也就是盡量去避免因為標本量不夠而做不出突變。

為了在下一步的群體SNP 檢測實驗中，從有限的樣本群體中檢測出有意義的突變，我們設立了SNP 位點的MAF＞0.1 的過濾標準，由表3 可以看出，滿足MAF＞0.1條件的SNP 位點有40 個，其中有31個SNP 位點為首次發(fā)現(xiàn)。

四、結論

本研究采用目標區(qū)域基因重測序技術，以Canfam 2.0 基因組為參照，通過軟件分析比對，研究了犬OR 基因的多態(tài)性，對發(fā)現(xiàn)的OR 基因的SNP 位點的基因頻率、基因型頻率進行了統(tǒng)計。結果共發(fā)現(xiàn)工作犬OR 基因SNP位點67 個，對所有的SNP 根據(jù)MAF ＞0.1 過濾，共得到高一致性的群體SNP 位點40 個，其中有31個SNP 位點為首次發(fā)現(xiàn)。

表 3 SNP 最小等位基因頻率

備注：MAF：最小等位基因頻率，minor allele frequency；

本研究篩選出來的31個SNP 位點，可以為下一步開展工作犬OR 基因群體SNP 檢測分型實驗研究，分析不同SNP 基因型與工作犬嗅覺探測能力之間的關聯(lián)性，尋找與犬嗅探能力相關的分子標記位點奠定研究基礎。