白芷HPLC指紋圖譜的研究

張 燁，孫艷雪，馬宇衡, 屠鵬飛，薛培鳳*

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 中藥現(xiàn)代研究中心，北京 100029）

白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.) Shan et Yuan的干燥根，為《中國藥典》（2015年版一部）收載的中藥材之一。白芷為傳統(tǒng)中醫(yī)臨床常用藥物，其藥用價(jià)值較為廣泛，其銷量也在逐年增加，在中藥材的對外交易中占重要地位，遠(yuǎn)銷日本、東南亞等地。由于野生資源日益匱乏，現(xiàn)在的白芷主要為栽培品[1]。

白芷藥用歷史悠久，具有鎮(zhèn)痛[2]、抗炎[3]、美白[4]、抗腫瘤[5]等功效。白芷化學(xué)成分較為復(fù)雜，主要為香豆素類[6]和揮發(fā)油類[7]。白芷一般按其產(chǎn)地分為杭白芷、川白芷、禹白芷和祁白芷。受藥材植物來源、生長環(huán)境、加工方式等因素的影響，不同產(chǎn)地的白芷質(zhì)量也會存在一定差異[8]。加之與日俱增的白芷代用品、相似品和地方白芷品種在市場上交易，因此需創(chuàng)建一個(gè)全面的、系統(tǒng)的白芷質(zhì)量控制分析方法。中藥指紋圖譜具有全息性、客觀性、準(zhǔn)確性、整體性及模糊性的特征，能較好地表征中藥化學(xué)物質(zhì)組成的整體性及復(fù)雜性，全面地反映中藥中的化學(xué)成分信息，被廣泛運(yùn)用到中藥質(zhì)量評價(jià)中[9]。

本文采用二元梯度洗脫模式，建立了不同產(chǎn)地的21批白芷藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。共確定了20個(gè)共有色譜峰，并將其色譜峰導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012A版）軟件，對其質(zhì)量進(jìn)行評價(jià), 取得了較為滿意的結(jié)果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030C高效液相色譜儀（包括四元泵，在線脫氣機(jī)，自動進(jìn)樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器，日本島津）； BSA124S型電子分析天平（Sartorius）；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司）。

1.2 試藥

本研究所用的21批白芷藥材采集于各地藥店。樣品經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院王素巍老師鑒定，見表1。樣品預(yù)處理：粉碎機(jī)粉碎，過4號篩（65目），置密封袋中，干燥、避光條件下密封保存并編號。歐前胡素對照品（批號：110826-201916），異歐前胡素對照品（批號：110827-201911），水合氧化前胡素對照品（批號：Y07M9H55367），比克白芷素對照品（批號：110826-201916），cnidilin對照品（批號：Y07M9Q45983）均購于上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)98 %以上。甲醇（色譜純，美國J T Baker公司）；其他試劑均為分析純；雙蒸水（自制）。

1.3 數(shù)據(jù)處理軟件

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件（2012A版）對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Extend C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.01 %三氟乙酸水溶液；B為甲醇。實(shí)驗(yàn)采用二元梯度洗脫（見表2）。流速為1 ml/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為300 nm，進(jìn)樣量10 μl。

表1 21批白芷樣品的來源

表2 梯度洗脫程序

2.2 對照品溶液制備

精密稱取歐前胡素對照品、異歐前胡素對照品適量，加甲醇制成每毫升含歐前胡素、異歐前胡素分別為20，10 μg的對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液制備

取白芷樣品粉末（過4號篩）約1.0 g，精密稱定，置50 ml具塞三角瓶中。加入甲醇25 ml，搖勻，稱定，密塞，編號并記錄。超聲提取1 h，共提取1次。提取結(jié)束后冷卻至室溫。用100 %甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，轉(zhuǎn)移至離心管中，離心，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)指南》[10]，將所得的色譜圖轉(zhuǎn)換成AIA格式后輸入相似度評價(jià)軟件，通過比較圖譜的相似度進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.4.1 精密度考察 按2.3項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次。將所得的色譜圖輸入相似度評價(jià)軟件進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其相似度均大于0.95，且各色譜峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD均小于0.5 %，符合指紋圖譜要求。

2.4.2 重現(xiàn)性考察 平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣分析，將所得的色譜圖輸入相似度評價(jià)軟件進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其相似度均大于0.95，且各色譜峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD均小于0.5 %，說明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件分別在0，2，4，8，16，24 h進(jìn)樣分析，將色譜圖輸入相似度評價(jià)軟件進(jìn)行比較。結(jié)果表明，其相似度均大于0.95，且各色譜峰相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD均小于0.5 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 白芷HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立及分析

取采集的21批白芷藥材樣品，分別按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，得到各批藥材的HPLC指紋圖譜。建立對照指紋圖譜（見圖1），并將所得色譜圖輸入相似度評價(jià)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

表3 21批白芷樣品的相似度評價(jià)結(jié)果

圖1 21批白芷樣品色譜重疊峰

標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜反映了藥材化學(xué)成分的基本特征，為不同批次的藥材比對提供了參考。本通過對21批次白芷樣品的相似度進(jìn)行比較可見，17號樣品藥材的指紋圖譜相似度較大，表明其質(zhì)量較好，較為完整地反映了白芷藥材的基本特征。因此可將此樣品的指紋圖譜作為白芷藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（見圖2）。

圖2 17號樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的比較

如圖2所示，標(biāo)定出20個(gè)共有峰。其中16號色譜峰滿足內(nèi)參照峰的2個(gè)條件：與相鄰的色譜峰分離良好；為各待測樣品共有色譜峰。

按2.1項(xiàng)色譜條件，將配制好的對照品溶液逐一進(jìn)行HPLC-DAD分析，經(jīng)與對照品的保留時(shí)間、紫外吸收等信息進(jìn)行比較，鑒別了標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜中的5個(gè)峰，結(jié)果見圖3。

圖3 白芷HPLC標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜色譜峰的鑒別

3 討論

3.1 供試品的制備方法考察

3.1.1 提取方法的考察 較常用的中藥化學(xué)成分的提取方法有超聲法、冷浸法及回流法。分別取以上3種提取方法所得的供試品溶液10 μl，進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲提取法峰面積相對較大。超聲波獨(dú)特的物理特性，使中藥有效成分提取更充分，提取效率更高，因此選用超聲提取法。

3.1.2 提取溶劑的考察 文獻(xiàn)多以乙醇及甲醇為提取溶劑。以乙醇及甲醇為溶劑，采用超聲法提取，而后進(jìn)樣分析。通過HPLC計(jì)算兩圖譜中色譜峰的數(shù)目、峰高及峰面積得出結(jié)論，甲醇提取效率明顯優(yōu)于乙醇，最終選擇甲醇作為提取溶劑。

3.1.3 提取條件的優(yōu)化 考察甲醇濃度，溶劑體積、提取時(shí)間、提取次數(shù)對白芷提取效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，取白芷樣品約1.0 g，加25 ml甲醇提取1 h，共提取1次，提取效果最佳。

3.2 色譜條件的選擇與優(yōu)化

3.2.1 檢測波長的選擇 本研究采用二極管陣列檢測器（DAD）在210～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，綜合比對不同波長下色譜圖中色譜峰的數(shù)目、峰高及峰面積，最終確定了300 nm為最佳檢測波長。

3.2.2 流動相的選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、甲醇-水-三氟乙酸、乙腈-水、乙腈-水-三氟乙酸4種流動相系統(tǒng)，其中用甲醇-水-三氟乙酸系統(tǒng)即能使其成分得到很好的分離。所以最終選定甲醇-三氟乙酸水作為流動相。

3.2.3 柱溫的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了25，30，35℃ 3個(gè)不同柱溫對的色譜峰的影響，通過比較，最終確定了柱溫為30 ℃時(shí)，各色譜峰的分離效果較好。

4 結(jié)論

本文選取了21批白芷樣品創(chuàng)建共有模式，較好地保證了共用模式創(chuàng)建的全面性、代表性和科學(xué)性。全國各地收集的21批白芷藥材相似度介于0.732～0.968之間，說明所收集樣品具有一定的代表性，與此同時(shí)反應(yīng)了市場上流通的白芷質(zhì)量良莠不齊，須加以區(qū)分。相似度在0.9以上的有19批，另外兩批相似度分別為0.732，0.783。由指紋圖譜可見，這兩批藥材12、13號峰的相對峰面積較大，相應(yīng)化學(xué)成分相對含量較高。結(jié)合紫外吸收特征，得出這兩種成分均為香豆素類。這兩個(gè)相對含量較高的化學(xué)成分是否為藥效成分，尚需進(jìn)一步研究。