慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者血清IFN-γ基因多態(tài)性分析*

高朋彬，趙曉彥，王德華，秦 浩，孟明輝，張建集，閆雙緩，鄭歡偉

慢加急性肝衰竭((acute on chronic liver failure，ACLF)是指在慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)急性肝損傷和肝功能失代償而導(dǎo)致的肝功能衰竭[1]。ACLF具有發(fā)病急、病情發(fā)展速度快，病情嚴(yán)重、治療困難且效果差、短期病死率高等特點(diǎn)，在臨床上受到廣泛的關(guān)注[2,3]。ACLF患者病死率高達(dá)50%～90%[4]。ACLF的病因較為復(fù)雜，在我國(guó)，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是導(dǎo)致ACLF的最主要的病因[5]。近年來(lái)，慢加急性乙型肝炎肝衰竭(HBV-ACLF)發(fā)病率逐年升高，部分地區(qū)HBV-ACLF在肝衰竭患者中占比已高達(dá)80%[6]。早期發(fā)現(xiàn)并采取積極的內(nèi)科治療可使患者病情得到顯著的緩解[7,8]。HBV-ACLF的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為機(jī)體免疫反應(yīng)異常起到了重要的作用[9]。γ-干擾素(IFN-γ)是人體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)重要的血清細(xì)胞因子，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等特征，在人體免疫防御過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[10,11]IFN-γ還參與誘導(dǎo)干細(xì)胞凋亡等[12]。有研究證明，IFN-γ基因與免疫應(yīng)答機(jī)制關(guān)系密切[13]。IFN-γ基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)可對(duì)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)過(guò)程造成影響，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞因子含量及免疫功能的差異。因此，我們猜測(cè)IFN-γ可能與HBV-ACLF發(fā)生存在一定的病理生理學(xué)關(guān)聯(lián)。本研究檢測(cè)了HBV-ACLF患者外周血IFN-γ基因SNP位點(diǎn)+874T/A和+2109A/G基因型和等位基因分布特征，以期為及時(shí)準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者預(yù)后提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2017年5月～2019年9月我院診治的HBV-ACLF患者60例，男性38例，女性22例；年齡為24～76歲，平均年齡為(47.45±6.24)歲。診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)發(fā)布的《肝衰竭診治指南》的標(biāo)準(zhǔn)[14]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有嚴(yán)重的心、腦功能障礙；(2)伴有惡性腫瘤或嚴(yán)重的全身性疾?。?3)經(jīng)影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)存在肝硬化；(4)近期使用過(guò)免疫調(diào)節(jié)劑治療。另選擇我院同期健康體檢人群60例為對(duì)照組，男性39，女性21例；年齡為23～74歲，平均年齡為(46.78±6.35)歲。全部研究對(duì)象或家屬簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)過(guò)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查。

1.2 基因提取和SNP位點(diǎn)基因分型檢測(cè) 空腹采集靜脈血5 mL，EDTA-K2或肝素抗凝，置于離心管中，加入TE 800μL混勻，在室溫下以12 000 r/m離心1 min，重復(fù)5～6次，直至完全溶解。再加入TE 400μL，10%SDS 25μL，20 mg/ml PK 5μL，37℃消化過(guò)夜。吸上層清液，加入等體積的酚，搖蕩15 min，以12000 r/min離心10 min，再次吸上層清液；加入等體積的酚：氯仿(1:1)，搖蕩15 min，以12000 r/min離心10 min，吸上清液；再加入等體積的氯仿，振蕩15 min，以12000 r/min離心10 min，吸上清液；加入兩倍體積的無(wú)水乙醇和1/10體積的3 M乙酸鈉，于-20℃下沉淀1 h，以12000 r/min離心10 min，棄上清液，向沉淀中加入75%乙醇，以12000 r/min離心5 min，棄上清液，干燥后用TE 100μL溶解，置于-20℃冷藏備用。使用羅氏LightCy-cler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，采用TaqMan探針熒光定量PCR法行IFN-γ SNP位點(diǎn)-159C/T基因分型(Taq-Man Genotyping Master Mix、TaqMan探針以及引物均購(gòu)自美國(guó)ABI公司。PCR反應(yīng)體積為10μL(引物見(jiàn)表1)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，92℃變性15 s、60℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)，40℃延伸5 min。應(yīng)用羅氏LightCycler480熒光定量分析軟件LCS480 1.5.1.62對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因分型。隨機(jī)對(duì)SNPs位點(diǎn)的不同基因型樣本進(jìn)行測(cè)序，以驗(yàn)證Taqman基因分型的結(jié)果。

表1 IFN-γ基因引物序列

1.3 肝腎功能指標(biāo)檢測(cè) 使用Stago-Evolution血凝儀(法國(guó)Stago公司)及其配套試劑檢測(cè)凝血酶原時(shí)間(prothrombin time)，計(jì)算凝血酶原活動(dòng)度(PTA)；使用日立7600全自動(dòng)生化分析儀及其配套試劑檢測(cè)肝腎功能指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用x2檢驗(yàn)和Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)IFN-γ基因SNP位點(diǎn)+874T/A和+2109A/G基因型和等位基因頻率分布差異，采用Logistic回歸模型計(jì)算基因型和基因組模型OR值及其95%置信區(qū)間(CI)，以P<0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組人群基本特征 見(jiàn)表2。

2.2 兩組IFN-γ基因+874T/A多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較 IFN-γ基因+874T/A位點(diǎn)存在TT、TA和AA三種基因型。ACLF患者與健康人基因型分布頻率存在顯著性差異(P<0.05)；在等位基因頻率分布結(jié)果中，ACLF患者T等位基因頻率顯著低于對(duì)照組，而A等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表3)，提示T等位基因是患者發(fā)生HBV-ACLF的保護(hù)性基因，而A等位基因可能是患者發(fā)生HBV-ACLF的風(fēng)險(xiǎn)基因。

表2 兩組人群基本特征

表3 兩組IFN-γ+874T/A位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布(%)比較

SNPACLF(N=60)對(duì)照組(N=60)x2OR(95%CI)P+874T/A基因型TT29(48.3)34(56.7)TA12(20.0)18(30.0)6.0780.82(0.51～1.43)0.048AA19(31.7)8(13.3)等位基因T70(58.3)86(71.7)4.6890.61(0.42～1.15)0.030A50(41.7)34(28.3)

2.3 兩組IFN-γ基因+2109A/G多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較 IFN-γ基因+2109A/G位點(diǎn)存在AA、AG和GG三種基因型。ACLF患者與健康人基因型分布頻率存在顯著性差異(P<0.05)；在基因型頻率分布結(jié)果中，ACLF患者顯性等位基因純合子AA基因型頻率顯著低于對(duì)照組，隱性等位基因純合子GG基因型頻率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；在等位基因頻率分布結(jié)果中，ACLF患者A等位基因頻率顯著低于對(duì)照組，G等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表4)，提示A等位基因是患者發(fā)生HBV-ACLF的保護(hù)性等位基因，而G等位基因可能是患者發(fā)生HBV-ACLF的風(fēng)險(xiǎn)等位基因。

表4 兩組IFN-γ+2109A/G位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布(%)比較

SNPACLF(N=60)對(duì)照組(N=60)x2OR(95%CI)P+2109A/G基因型AA32(53.3)40(66.7)AG11(18.3)14(23.3)6.5100.73(0.28～1.46)0.039GG17(28.3)6(10.0)等位基因A75(62.5)94(78.3)7.2210.75(0.61～1.84)0.007G45(37.5)26(21.7)

3 討論

在我國(guó)，ACLF是最常見(jiàn)的肝衰竭類(lèi)型，其中以HBV感染為病因的ACLF占絕大多數(shù)，可能系我國(guó)屬于HBV高發(fā)地區(qū)的原因[15]。肝移植是目前最有效的治療HBV-ACLF的方法，但其價(jià)格較為昂貴，且肝源無(wú)法滿(mǎn)足廣大患者的需求，且手術(shù)后需長(zhǎng)期使用免疫抑制劑進(jìn)行后續(xù)治療，因此肝移植治療的發(fā)展受到極大的限制。研究證明，早期發(fā)現(xiàn)并在合適的治療時(shí)機(jī)對(duì)HBV-ACLF患者采取合理有效的治療措施可大大緩解病情，甚至阻止疾病發(fā)展[7,8]。故及時(shí)準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)患者疾病進(jìn)展的發(fā)生對(duì)降低HBV-ACLF發(fā)病率和病死率具有重要的臨床意義。

細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)參與了病毒的清除和疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。IFN-γ、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL-6)等細(xì)胞因子與ACLF患者肝細(xì)胞壞死和預(yù)后密切相關(guān)[16]。在人體對(duì)于HBV的免疫應(yīng)答機(jī)制中，Th1細(xì)胞是主要的介導(dǎo)細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體清除HBV，在這個(gè)過(guò)程中，容易激發(fā)肝組織炎癥反應(yīng)，誘發(fā)肝衰竭[17]。

IFN-γ是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，可以活化T淋巴細(xì)胞，可激活單核巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分化，使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞活化，并通過(guò)活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞殺滅病毒。鑒于IFN-γ在清除HBV過(guò)程中的重要作用，我們猜測(cè)IFN-γ水平與患者發(fā)生HBV-ACLF存在某種因果關(guān)系。隨著對(duì)人類(lèi)基因研究的不斷發(fā)展，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到不同的基因背景可以對(duì)不同人群和一些疾病產(chǎn)生影響。對(duì)于基因多態(tài)性的研究可以幫助我們了解不同基因型人群疾病發(fā)病率的不同，從基因水平去闡述HBV-ACLF的發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)，細(xì)胞因子的基因多態(tài)性與疾病的易感性和臨床轉(zhuǎn)歸的研究受到了廣泛的關(guān)注。IFN-γ基因多態(tài)性與HBV感染有關(guān)[18,19]。IFN-γ基因位于人體第42號(hào)染色體上，跨度約為5.4 kb，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成[13]。IFN-γ+874T/A位點(diǎn)中TT基因型能促使人體產(chǎn)生高水平的IFN-γ，有助于人體對(duì)病毒感染的免疫防御，而TA和AA基因型的表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致人體IFN-γ水平降低，增加了病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，ACLF患者+874T/A位點(diǎn)TT基因型頻率顯著低于對(duì)照組，而A等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，提示+874T/A位點(diǎn)T等位基因是HBV-ACLF發(fā)生的保護(hù)性基因，而A等位基因是HBV-ACLF發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)基因。+874T/A和+2109A/G兩個(gè)SNP位點(diǎn)的DNA序列均是NF-kB信號(hào)通路的特異性結(jié)合位點(diǎn)，可能影響人體IFN-γ的表達(dá)，且該通路受到影響還會(huì)導(dǎo)致氧化損傷，提示+2109A/G位點(diǎn)也與人體IFN-γ的表達(dá)有關(guān)。本研究關(guān)于+2109A/G位點(diǎn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACLF患者AA基因型頻率為53.3%，顯著低于對(duì)照組的66.7%，且ACLF患者A等位基因頻率為37.5%，顯著高于對(duì)照組的21.7%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，驗(yàn)證了我們的猜想。