自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)與快速流式細(xì)胞術(shù)在白細(xì)胞減少性疾病診治中的價(jià)值

郭 平，陳驪婷，廖 兵，王劍飚

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025；2.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200025）

近年來用于白細(xì)胞分類的新技術(shù)不斷涌現(xiàn)出來，自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)和快速流式細(xì)胞術(shù)是其中具有代表性的2種方法。自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖像識(shí)別技術(shù)完成形態(tài)特征的提取、映射和識(shí)別，具有檢測(cè)時(shí)間短、分類相關(guān)性好的特點(diǎn)[1-2]?？焖倭魇郊?xì)胞術(shù)是采用一步法標(biāo)記抗體、免去細(xì)胞洗滌、軟件自動(dòng)設(shè)門的外周血白細(xì)胞分類技術(shù)。本研究擬探討上述2種方法在白細(xì)胞減少性疾病中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年1—10月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院就診且白細(xì)胞計(jì)數(shù)為（0.5～2.0）×109/L的患者181例，其中急性髓系白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）（包括化療中）66例、急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphocytic leukemia，ALL）（包括化療中）39例、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）25例、淋巴瘤（包括化療中）31例、慢性乙型肝炎20例。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 FC500流式細(xì)胞儀及配套試劑，包括細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)╒ersaLyse Solution）、細(xì)胞保存液（IOTest3）、流式細(xì)胞精密度質(zhì)控微球（Flow-Check Pro Florospheres）和組合抗體含簇分化抗原（cluster of differentiation，CD）45、CD36、CD16、CD19、CD2和CD294均購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。SP-10自動(dòng)推染片機(jī)（以下簡(jiǎn)稱SP10）及配套試劑均購(gòu)自日本Sysmex公司。CellaVision DM96自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)購(gòu)自瑞典CellaVision公司。

1.2.2 檢測(cè)流程 采集患者靜脈全血2 mL，用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，混勻后于2 h內(nèi)完成檢測(cè)。隨機(jī)挑選20份低值白細(xì)胞標(biāo)本分別用顯微鏡鏡檢法、自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)和快速流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)并計(jì)時(shí)。使用SP-10進(jìn)行推片、染色，每份標(biāo)本制作至少2張血涂片，以滿足顯微鏡鏡檢及自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)要求。顯微鏡鏡檢法：每份標(biāo)本由高年資技師人工顯微鏡鏡檢分類計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞并記錄耗時(shí)與結(jié)果。自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)：記錄100個(gè)白細(xì)胞自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類及自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核的耗時(shí)與結(jié)果?？焖倭魇郊?xì)胞術(shù)：預(yù)先將細(xì)胞保存液與細(xì)胞分析用溶血?jiǎng)┮?∶40的比例配制成裂解固定液。將10 μL組合抗體與100 μL抗凝血混勻，室溫避光靜置15 min，隨后加入1 mL裂解固定液，混勻后室溫避光靜置10 min，檢測(cè)前使用Flow-Check檢查儀器狀態(tài)，分類計(jì)數(shù)10000個(gè)有核細(xì)胞，儀器自動(dòng)設(shè)門計(jì)算細(xì)胞百分比，根據(jù)需要適當(dāng)調(diào)整設(shè)門位置，記錄操作耗時(shí)與檢測(cè)結(jié)果。選取白細(xì)胞計(jì)數(shù)在2.0×109/L左右、存在一定數(shù)量原始細(xì)胞的標(biāo)本，依次應(yīng)用上述方法連續(xù)檢測(cè)11次，去除第1次結(jié)果后計(jì)算后10次中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和原始細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的精密度。

1.3 原始細(xì)胞陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)

顯微鏡鏡檢法和自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核原始細(xì)胞百分比≥1%時(shí)記為陽(yáng)性?？焖倭魇郊?xì)胞術(shù)原始細(xì)胞百分比≥0.5%時(shí)記為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以表示。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（最小值，最大值）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析評(píng)估各種方法間的相關(guān)性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)估各種方法檢測(cè)原始細(xì)胞的性能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)耗時(shí)比較

顯微鏡鏡檢法耗時(shí)最長(zhǎng)，自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類耗時(shí)最短，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 4種方法白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)耗時(shí)比較 s

2.2 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)精密度比較

快速流式細(xì)胞術(shù)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、原始細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果的離散度優(yōu)于其他3種方法，顯微鏡鏡檢法分類計(jì)數(shù)結(jié)果的離散度最大。見表2。

2.3 原始細(xì)胞陽(yáng)性符合率比較

對(duì)181例標(biāo)本進(jìn)行顯微鏡鏡檢，發(fā)現(xiàn)原始細(xì)胞陽(yáng)性98例，陰性83例。顯微鏡鏡檢示原始細(xì)胞陽(yáng)性的98例標(biāo)本中，快速流式細(xì)胞術(shù)檢出原始細(xì)胞陽(yáng)性93例（94.9%），假陰性5例；自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類檢出原始細(xì)胞陽(yáng)性53例（54.1%），假陰性45例；自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核檢出原始細(xì)胞陽(yáng)性78例（79.6%），假陰性20例。見表3。

表2 4種方法白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果 %，

表2 4種方法白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果 %，

表3 3種方法原始細(xì)胞陽(yáng)性符合率比較

2.4 3種方法原始細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果與顯微鏡鏡檢法的相關(guān)性

快速流式細(xì)胞術(shù)和自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核原始細(xì)胞分類結(jié)果與顯微鏡鏡檢法的相關(guān)性較好（r值分別為0.937、0.990，P＜0.001），自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類與顯微鏡鏡檢法的相關(guān)性較差（r=0.507，P＜0.001）。見表4。

表4 3種方法原始細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果與顯微鏡鏡檢法的相關(guān)性比較

2.5 3種方法檢測(cè)原始細(xì)胞的性能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，快速流式細(xì)胞術(shù)、自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核和自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類檢測(cè)原始細(xì)胞的曲線下面積分別為0.97、0.90、0.63。自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類檢測(cè)原始細(xì)胞的敏感性和特異性均最低，快速流式細(xì)胞術(shù)的敏感性最高，自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核的特異性最高（100.00%）。見表5、圖1。

表5 3種方法檢測(cè)原始細(xì)胞的性能比較

圖1 原始細(xì)胞檢測(cè)的ROC曲線

3 討論

顯微鏡鏡檢是白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但其準(zhǔn)確性受制片質(zhì)量、觀察部位、檢驗(yàn)人員水平等諸多因素影響[3-4]，檢測(cè)效率更是與白細(xì)胞計(jì)數(shù)密切相關(guān)。白血病患者使用的細(xì)胞毒性化療藥物往往會(huì)抑制骨髓生長(zhǎng)，引起白細(xì)胞數(shù)量的下降和形態(tài)變化[5]，這些因素不同程度地增加了顯微鏡鏡檢的時(shí)間和難度。因此，理想的白細(xì)胞分類技術(shù)應(yīng)在具備顯微鏡鏡檢優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上盡可能減少不足之處。

在臨床標(biāo)本不斷攀升、人員工作量趨近飽和的背景下，提高檢測(cè)速度是確保標(biāo)本周轉(zhuǎn)時(shí)間（turn-around time，TAT）的前提。本研究結(jié)果顯示，白細(xì)胞數(shù)量減少時(shí)，顯微鏡鏡檢法單次白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)耗時(shí)約15 min，而快速流式細(xì)胞術(shù)由于通量高、速度快，中位耗時(shí)約5 min，約為顯微鏡鏡檢法的32%。自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)通過“城垛式”閱片的方式迅速定位細(xì)胞，提取特征后利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)判斷細(xì)胞類別，因此自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類速度更快，中位時(shí)間僅為顯微鏡鏡檢法的22%。在預(yù)分類的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工審核需時(shí)約6 min，約為顯微鏡鏡檢法的42%，其中人員操作時(shí)間只需3 min左右，有效減輕了工作負(fù)擔(dān)。

提升白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)精密度是保證檢驗(yàn)質(zhì)量的條件。本研究結(jié)果顯示，快速流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、原始細(xì)胞的離散度優(yōu)于自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類、自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核和顯微鏡鏡檢法，主要原因在于快速流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)量更多，閱片或掃描區(qū)域更大?？焖倭魇郊?xì)胞術(shù)單次檢測(cè)104個(gè)細(xì)胞，而顯微鏡鏡檢法或自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)由于以血涂片為載體，用于分類的白細(xì)胞數(shù)量?jī)H為100～200個(gè)；此外，顯微鏡鏡檢法或自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)在白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)時(shí)無法保證每人每次閱片或者儀器掃描的區(qū)域完全相同。因此，白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果的離散度自然高于快速流式細(xì)胞術(shù)。

白血病治療過程中外周血原始細(xì)胞的清除率反映患者對(duì)藥物的敏感性，是指導(dǎo)臨床用藥、提示疾病預(yù)后的依據(jù)之一[6-9]。而計(jì)算清除率的前提是檢測(cè)方法檢出原始細(xì)胞的能力。本研究結(jié)果顯示，以顯微鏡鏡檢法為參考方法，原始細(xì)胞陽(yáng)性符合率由高到低依次為快速流式細(xì)胞術(shù)（94.9%）、自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核（79.6%）和自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類（54.1%）。快速流式細(xì)胞術(shù)對(duì)原始細(xì)胞的判斷基于細(xì)胞膜CD45的表達(dá)，受細(xì)胞形態(tài)變化干擾小，因此僅有5例標(biāo)本假陰性和1例標(biāo)本假陽(yáng)性。假陰性標(biāo)本來自AML化療患者，顯微鏡鏡檢見幼稚單核細(xì)胞，形態(tài)學(xué)上這類細(xì)胞與原始細(xì)胞意義相同[10]，在顯微鏡鏡檢時(shí)歸入原始細(xì)胞。但幼稚單核細(xì)胞CD45表達(dá)程度高于原始細(xì)胞，自動(dòng)設(shè)門時(shí)歸為成熟單核細(xì)胞。假陽(yáng)性標(biāo)本來自多發(fā)性骨髓瘤患者，顯微鏡鏡檢可見大量漿細(xì)胞。由于組合抗體中沒有針對(duì)漿細(xì)胞的抗體，而散點(diǎn)圖中漿細(xì)胞CD45表達(dá)程度弱于其他正常細(xì)胞，設(shè)門時(shí)自動(dòng)計(jì)入原始細(xì)胞，造成原始細(xì)胞比例假性升高。此類問題最好的解決策略是增加標(biāo)記抗體種類或優(yōu)化設(shè)門邏輯。國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)提出，使用8～10色的流式細(xì)胞術(shù)用于外周血白細(xì)胞分類，但上述方案目前仍在評(píng)估，進(jìn)入臨床尚需時(shí)日[11-12]。自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類有45例假陰性標(biāo)本和21例假陽(yáng)性標(biāo)本。假陰性標(biāo)本多來自ALL化療患者，原始淋巴細(xì)胞在藥物誘導(dǎo)下數(shù)量減少且形態(tài)變化，儀器將其歸入淋巴細(xì)胞、涂抹細(xì)胞或無法識(shí)別的細(xì)胞等。COVUT等[9]的研究結(jié)果顯示，自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)在預(yù)分類時(shí)原始淋巴細(xì)胞數(shù)量往往被嚴(yán)重低估，在未進(jìn)行化療的標(biāo)本中這些細(xì)胞多被計(jì)入成熟淋巴細(xì)胞。假陽(yáng)性標(biāo)本中誤分類為“原始細(xì)胞”的有反應(yīng)性淋巴細(xì)胞、未成熟粒細(xì)胞、發(fā)生退化的淋巴細(xì)胞等。上述情況在人工審核后有所改善，儀器的錯(cuò)誤分類得以糾正，因此假陰性標(biāo)本和假陽(yáng)性標(biāo)本數(shù)明顯下降。

本研究結(jié)果顯示，即使白細(xì)胞減少，快速流式細(xì)胞術(shù)原始細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果與顯微鏡鏡檢法（參考方法）仍有良好的相關(guān)性（r=0.937），與KAHNG等[13]的研究結(jié)果一致。但本研究得出的r值高于KAHNG等[13]的結(jié)果（r=0.8325），可能與研究對(duì)象的例數(shù)及參考方法計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)量不同有關(guān)。自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類與顯微鏡檢法的相關(guān)性較差（r=0.507），但自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核與顯微鏡鏡檢法的r值可達(dá)0.990，這與人工審核后原始細(xì)胞陽(yáng)性符合率的變化一致。

ROC曲線分析結(jié)果顯示，快速流式細(xì)胞術(shù)及自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核檢測(cè)原始細(xì)胞的曲線下面積分別為0.97和0.90，對(duì)標(biāo)本中原始細(xì)胞的有無具有幾乎相同的區(qū)分能力?？焖倭魇郊?xì)胞術(shù)檢測(cè)原始細(xì)胞的敏感性更高，可達(dá)94.90%，這與流式細(xì)胞術(shù)相對(duì)更高數(shù)量級(jí)的細(xì)胞檢測(cè)數(shù)、特異性單克隆抗體的使用及設(shè)門邏輯有關(guān)[14]，但受抗體種類的制約。當(dāng)細(xì)胞分化抗原表達(dá)上調(diào)或下降，組合抗體未包含識(shí)別某一類細(xì)胞的抗體時(shí)，結(jié)果會(huì)出現(xiàn)偏差。自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核的特異性可達(dá)100%，但敏感性不到80%，原因?yàn)閮x器漏檢了對(duì)部分原始細(xì)胞比例為1%～2%。白細(xì)胞數(shù)量少，原始細(xì)胞比例過低，細(xì)胞分布不均以及檢測(cè)時(shí)的隨機(jī)誤差可能是造成這種現(xiàn)象的原因[15-16]。鑒于自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)有較快的檢測(cè)速度，適當(dāng)增加自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類的細(xì)胞數(shù)量可能是目前最有效的解決方式。EILERTSEN等[17]的研究結(jié)果顯示，自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類的原始細(xì)胞檢測(cè)敏感性高于自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核，與本研究結(jié)果相反，推測(cè)該研究的技術(shù)人員誤將原始細(xì)胞辨認(rèn)為其他細(xì)胞。部分原始細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在儀器顯示屏上不易辨認(rèn)[15]可能是分類錯(cuò)誤的原因，提示當(dāng)儀器對(duì)細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)顯示不清晰時(shí)，應(yīng)結(jié)合顯微鏡進(jìn)行觀察。

綜上所述，白細(xì)胞數(shù)量減少時(shí)快速流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原始細(xì)胞精密度高、速度快、結(jié)果準(zhǔn)確；自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)預(yù)分類+人工審核的方式檢測(cè)原始細(xì)胞高效、特異，同時(shí)可降低工作負(fù)擔(dān)。不同方法的合理組合可提高白細(xì)胞減少性疾病原始細(xì)胞檢測(cè)的敏感性、特異性及檢測(cè)效率，對(duì)疾病的診斷、治療和預(yù)后判斷具有重要意義。