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    采用響應(yīng)曲面法對(duì)Capto adhere填料進(jìn)行工藝優(yōu)化

    2020-05-26 12:05:55吳光昊何慧丹徐翀颿顧鑫劉彥君
    上海醫(yī)藥 2020年9期

    吳光昊 何慧丹 徐翀颿 顧鑫 劉彥君

    摘 要 為對(duì)復(fù)合陰離子Capto adhere 填料進(jìn)行純化工藝優(yōu)化,在前期單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,CHO細(xì)胞表達(dá)的IgG1型單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)上清液經(jīng)親和層析純化后,采用中心復(fù)合表面設(shè)計(jì)(CCF)法優(yōu)化Capto adhere 填料純化工藝。以收率、純度、HCP清除率為響應(yīng)變量,考察pH、電導(dǎo)率、載量3個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)純化工藝的影響,擬合模型并驗(yàn)證。優(yōu)化后最佳工藝條件為:pH 7.0,電導(dǎo)率 16.4 ms/cm,載量300 mg/ml,在此條件下,收率、純度和HCP清除率分別可達(dá)(90.77±0.77)%、 (99.55±0.05)%和(88.93±2.14)%。與預(yù)測(cè)結(jié)果偏差均<5%,模型得到驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果表明本研究Capto adhere 填料工藝優(yōu)化是有效可行的。

    關(guān)鍵詞 中心復(fù)合設(shè)計(jì) Capto adhere 抗體純化

    中圖分類號(hào):TQ464.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1006-1533(2020)09-0067-05

    Optimization of Capto adhere purification conditions using response surface design

    WU Guanghao1*, HE Huidan1, XU Chongfan1, GU Xin1, LIU Yanjun2

    (1. Shanghai Jiaolian Drug Research and Development Co., Ltd., Shanghai 201210, China; 2. Central Research Institute, Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd., Shanghai 201210, China)

    ABSTRACT In order to optimize the purification process of multimodal anion exchange chromatography media Capto adhere, the purification process by Capto adhere was optimized by central composite surface design method after the cell culture supernatant for the expression of monoclonal antibody IgG1 in CHO cells was purified by affinity chromatography. The effects of three key factors such as pH value, conductivity and load on the purification process were investigated using the yield, purity and HCP removal rate as responses, and then the fitting model was validated. The conditions for optimum process were pH 7.0, conductivity 16.4 ms/cm and load 300 mg/ml. The results showed that the yield, purity and HCP removal rate were(90.77±0.77)%, (99.55±0.05)% and (88.93±2.14)%, respectively. The deviations from the predicted results were all less than 5% and the model was validated. The experimental results show that the optimization of purification process by Capto adhere is effective and feasible.

    KEy WORDS center composite design; Capto adhere; antibody purification

    近年來(lái),治療性單克隆抗體(monoclonal antibodies,mAbs)藥物在許多疾病治療(如癌癥)方面扮演著重要的角色,該治療方法需要在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)供給高劑量的抗體[1]。面對(duì)高需求量的單克隆抗體藥物市場(chǎng),生物公司需要開(kāi)發(fā)新的上下游抗體工藝以減小生產(chǎn)成本。對(duì)于上游單抗生產(chǎn)來(lái)說(shuō),現(xiàn)在的抗體滴度已能達(dá)到5~10 g/L;對(duì)于下游的抗體純化來(lái)說(shuō),一般的三步純化步驟可占總生產(chǎn)成本的50%~80%[2]:首先通過(guò)親和層析捕獲目的蛋白同時(shí)去除大量的宿主細(xì)胞蛋白殘留(host cell protein, HCP),DNA以及病毒;然后通過(guò)兩步純化(中度純化、精細(xì)純化,通常為離子交換層析和疏水層析的組合)進(jìn)一步去除HCP、聚體以及蛋白A(protein A,PA)[3-4]。為提高純化效率和抗體收率,減少生產(chǎn)成本,復(fù)合層析填料應(yīng)運(yùn)而生。

    Capto adhere是一種應(yīng)用于生物過(guò)程技術(shù)的復(fù)合陰離子填料,配基為N-芐基-N-甲基乙醇胺,該配基同時(shí)具有:①離子相互作用;②氫鍵作用;③疏水作用。在流穿模式下,Capto adhere可吸附HCP,PA,病毒,內(nèi)毒素等,而抗體流穿,一步去除關(guān)鍵雜質(zhì),可與親和層析結(jié)合組成兩步純化工藝進(jìn)而達(dá)到提高收率的目的[5]。

    試驗(yàn)設(shè)計(jì)(design of experiments,DOE)是一種基

    于數(shù)理統(tǒng)計(jì)原理研究多個(gè)因子與響應(yīng)變量關(guān)系的一種科學(xué)有效的方法,其中響應(yīng)曲面法在生物過(guò)程優(yōu)化應(yīng)用中最為廣泛[6]。為實(shí)現(xiàn)流穿模式下Capto adhere填料性能的最優(yōu)化,本試驗(yàn)在前期單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法,對(duì)三種關(guān)鍵工藝參數(shù)pH,電導(dǎo)率,載量進(jìn)行優(yōu)化,作為放大生產(chǎn)的依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    AKTA avant、填料Mabselect及填料Capto adhere(柱體積CV=1.7 ml)購(gòu)自美國(guó)GE公司;層析柱購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;無(wú)水枸櫞酸、二水合枸櫞酸鈉(湖南爾康制藥股份有限公司);Tris(Applichem Gmbh-An ITW公司)。

    培養(yǎng)液是經(jīng)上游CHO細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)的IgG1單克隆抗體(自主研制生產(chǎn)),經(jīng)過(guò)Mabselect親和層析純化后得到800 ml樣品,濃度為13.7 mg/ml,純度為98.2%,HCP殘留的體積分?jǐn)?shù)為0.297 1%。

    1.2 方法

    1.2.1 中心復(fù)合表面設(shè)計(jì)

    在前期的單因素試驗(yàn)中,確定pH、電導(dǎo)率、載量的范圍分別為:5~7,3~20 ms/cm,100~300 mg/ml。根據(jù)CCF試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用Design-Expert V8.0.6.1(Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN)進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)(表1)。

    選擇中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)3次,系統(tǒng)生成17個(gè)試驗(yàn),包括8個(gè)角點(diǎn),6個(gè)軸點(diǎn),1個(gè)中心點(diǎn)(重復(fù)試驗(yàn)3次),未設(shè)計(jì)分組。本次試驗(yàn)按照系統(tǒng)所生成的隨機(jī)順序進(jìn)行(表2)。

    1.2.2 樣品處理

    配制20 mmol/L枸櫞酸緩沖液,pH和電導(dǎo)率如表2,然后分別用1 mol/L Tris溶液和20 mmol/L枸櫞酸+1 mol/L NaCl溶液調(diào)節(jié)pH和電導(dǎo)率使與緩沖液一致,樣品來(lái)源于Mabselect親和層析純化得到的產(chǎn)物。

    1.2.3 色譜條件

    將Capto adhere層析柱用20 mmol/L枸櫞酸緩沖液充分平衡后,以0.4 ml/min的上樣速度上樣,達(dá)到相應(yīng)條件下的載量。再用平衡緩沖液充分平衡并收集流穿液。

    2 結(jié)果

    將表2數(shù)據(jù)輸入軟件Design-Expert V8.0.6.1,獲得試驗(yàn)分析結(jié)果。試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析分為以下幾個(gè)部分:模型擬合;模型診斷及ANOVA分析;模型分析及驗(yàn)證。設(shè)定響應(yīng)值上下限分別為收率90%~100%,純度99%~100%,HCP清除率0~100%,利用軟件分析生成響應(yīng)曲面,在給定因子水平范圍內(nèi)得出最佳點(diǎn)及操作范圍并對(duì)最終模型進(jìn)行驗(yàn)證。

    分別對(duì)響應(yīng)變量收率,純度,HCP清除率及3因子pH,電導(dǎo)率,載量進(jìn)行二階模型擬合,各響應(yīng)變量擬合方程分別為:

    Y1,Y2,Y3分別代表響應(yīng)變量收率,純度及HCP清除率;A,B,C分別代表因子pH,電導(dǎo)率和載量。結(jié)果表明,二階方程(1)、(2)、(3)線性擬合程度良好,對(duì)應(yīng)R2分別為0.73,0.81,0.92,表示模型分別能夠解釋73%,80%,92%的均值方差;變異系數(shù)CV值分別為4.14%,0.18%,4.12%,,該試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值偏差較小,具有較高的精度,并且試驗(yàn)具有高度可靠性;信噪比分別為8.353,9.558,11.041,一般來(lái)說(shuō),信噪比大于4說(shuō)明具有較高的信號(hào)值[7],3個(gè)模型信噪比均大于4,說(shuō)明試驗(yàn)信號(hào)良好??傮w來(lái)說(shuō),3個(gè)響應(yīng)變量與獨(dú)立因子pH,電導(dǎo)率,載量的回歸模型均具有較高的線性擬合度及可靠性。

    2.1 模型診斷及ANOVA分析

    觀察殘差正態(tài)性檢驗(yàn)圖及殘差相對(duì)于觀測(cè)值順序?yàn)闄M軸的散點(diǎn)圖,殘差符合正態(tài)分布,無(wú)明顯奇異點(diǎn)(圖未給出);Box-Cox圖顯示l均等于1(圖未給出),表明數(shù)據(jù)符合正態(tài)性分布,無(wú)須做冪次變換。

    收率響應(yīng)曲面擬合方程方差分析結(jié)果如表3所示。

    純度響應(yīng)曲面擬合方程方差分析結(jié)果如表4所示。

    純度響應(yīng)曲面擬合方程方差分析結(jié)果如表5所示。

    以上ANOVA分析結(jié)果顯示回歸模型均具有顯著性(P值均小于0.05),其中響應(yīng)變量純度及HCP清除率擬合模型具有極顯著性(P值均小于0.01)。對(duì)模型進(jìn)行失擬檢驗(yàn),失擬項(xiàng)(lack of fit)F值為失擬平方和與純誤差平方和的比值,在三個(gè)模型中,失擬項(xiàng)F值均較低,P值分別為0.099 9,0.079 0,0.388 6,均大于0.05,表明模型擬合良好,模型可信。

    2.2 模型分析驗(yàn)證

    根據(jù)試驗(yàn)?zāi)P蛿M合出響應(yīng)曲面圖及等高線圖可以直觀地看出響應(yīng)變量與各水平因子之間的關(guān)系及各因子之間的相互作用(圖1)。等高線越密集說(shuō)明響應(yīng)變量對(duì)因子的變化越為敏感,載量設(shè)定為300 mg/ml時(shí),固定電導(dǎo)率,隨著pH的增加,收率和純度也將增加,并且增幅較大,而HCP清除率隨之減少;固定pH,隨著電導(dǎo)率的增加,純度和HCP清除率相應(yīng)減小,而收率變化呈“U”型,這些結(jié)果均說(shuō)明需將各因子調(diào)整至合適水平以達(dá)到給定水平范圍內(nèi)最佳效果。

    根據(jù)軟件給出的最佳點(diǎn),將pH調(diào)至7.00,電導(dǎo)率調(diào)至16.4 ms/ml,載量300 mg/ml,對(duì)該最佳點(diǎn)進(jìn)行工藝驗(yàn)證,在該條件下重復(fù)試驗(yàn)兩次,所得結(jié)果為收率(90.77±0.77)%,與預(yù)測(cè)值(94.67%)相差4.12%,純度(99.55±0.05)%,與預(yù)測(cè)值(99.27%)相差0.29%,HCP清除率(88.93±2.14)%,與預(yù)測(cè)值(87.07%)相差2.00%。結(jié)果偏差均<5%。說(shuō)明所擬合響應(yīng)曲面模型具有較好的可信度和預(yù)測(cè)精度。

    將響應(yīng)值上下限分別設(shè)定為收率90%~100%,純度 99%~100%,HCP清除率0~100%,利用軟件分析得出操作區(qū)間如圖2所示,隨著載量的增加,操作區(qū)域也繼續(xù)增加,考慮到pH,電導(dǎo)率及載量的調(diào)控難易程度,將載量操作范圍確定為250~300 mg/ml,pH操作范圍設(shè)定為6.8~7.0,從而可確定電導(dǎo)率操作范圍為11.8~18.0 ms/cm(圖2A)。

    3 討論

    為提高收率及純度,有必要對(duì)下游的抗體純化工藝進(jìn)行優(yōu)化,而親和層析往往是第一步。由于Protein A親和層析具有的高性能,其對(duì)單抗具有高度的選擇性,并且單抗在經(jīng)過(guò)Protein A親和層析步后,能夠達(dá)到很高的純度,因此很難找到能夠替代該填料的選擇以取代該步驟[8]。而在純化的后續(xù)步驟中,若能將多步純化步驟整合為一步,將大大提高生產(chǎn)效率。使用復(fù)合填料可整合離子交換及疏水層析,是純化工藝的一大趨勢(shì)。為確定復(fù)合填料Capto adhere范圍內(nèi)的最佳工藝條件,在本次實(shí)驗(yàn)中,我們采用響應(yīng)曲面的方法進(jìn)行DOE設(shè)計(jì),對(duì)復(fù)合填料Capto adhere工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,條件優(yōu)化后的收率達(dá)(90.77±0.77)%,純度達(dá)(99.55±0.05)%,相對(duì)于傳統(tǒng)三步層析純化,本研究采用親和層析、Capto adhere兩步純化步驟,有效地提高了收率及純度,降低了成本。

    一般來(lái)說(shuō),對(duì)于3因子3水平的DOE實(shí)驗(yàn),采用中心復(fù)合序貫設(shè)計(jì)的方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)是較為常見(jiàn)的方法,設(shè)計(jì)點(diǎn)包括8個(gè)角點(diǎn),6個(gè)星點(diǎn)及一個(gè)中心點(diǎn),星點(diǎn)為給定范圍之外的點(diǎn)。該種方法特點(diǎn)是具有序貫性和旋轉(zhuǎn)性[9],響應(yīng)變量的預(yù)測(cè)精度在以設(shè)計(jì)中心為球心的球面上是相同的。本研究采用中心復(fù)合表面設(shè)計(jì)而非中心復(fù)合序貫設(shè)計(jì),使得設(shè)計(jì)點(diǎn)均在給定范圍之內(nèi),原因是本次試驗(yàn)中電導(dǎo)率設(shè)計(jì)范圍為3~20 ms/cm,若采用中心復(fù)合序貫設(shè)計(jì),取給定范圍之外的星點(diǎn),則設(shè)計(jì)點(diǎn)將存在負(fù)值,對(duì)于電導(dǎo)率來(lái)說(shuō),不存在負(fù)值。此外,由于抗體經(jīng)親和層析所得樣品電導(dǎo)率為1 ms/cm左右,電導(dǎo)率調(diào)至過(guò)高將消耗大量鹽,考慮工藝放大時(shí)的生產(chǎn)成本,將實(shí)驗(yàn)點(diǎn)設(shè)計(jì)在給定范圍之內(nèi),故而采用中心復(fù)合表面設(shè)計(jì),這也是響應(yīng)曲面未出現(xiàn)峰值的原因。

    本研究中,收率擬合模型R2=0.73,這可能是由于試驗(yàn)過(guò)程中采用手動(dòng)收樣,存在收樣誤差而導(dǎo)致數(shù)據(jù)擬合略有偏差,從而導(dǎo)致R2值相較于純度及HCP清除率響應(yīng)模型擬合R2值略低。ANOVA分析結(jié)果顯示電導(dǎo)率及載量對(duì)收率有顯著影響,pH影響不顯著,且收率均較高,這可能是由于pH 5~7的范圍均小于蛋白等電點(diǎn)(pI=8.7),較低的pH下,蛋白帶正電,靜電相互作用力將變?nèi)?,進(jìn)而導(dǎo)致較高的收率[10]。載量對(duì)于純度及HCP清除率均無(wú)顯著影響,原因可能是載量試驗(yàn)范圍較小(100~300 mg/ml),導(dǎo)致影響不顯著。

    復(fù)合填料的出現(xiàn)使得純化步驟精簡(jiǎn)、成本降低、收益提高成為可能;DOE使得工藝開(kāi)發(fā)及優(yōu)化試驗(yàn)次數(shù)大大減少;為實(shí)現(xiàn)該填料的性能最大化,其工藝開(kāi)發(fā)和優(yōu)化還有待進(jìn)一步深入研究。

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