雷帕霉素對(duì)大鼠腎缺血再灌注后心肌損傷的作用及機(jī)制研究

鄧 宇，李麗娜，王鵬帆，張營帥，曹福源，張 偉

(1.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063210；2.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063210；3.華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，河北 唐山 063210；4.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063210)

在腎移植和腎腫瘤切除術(shù)等一些復(fù)雜的腎手術(shù)中，需要暫時(shí)阻斷腎血流。術(shù)后再灌注過程會(huì)加重缺血性腎組織損傷，該過程稱為腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion，RIR)[1]。RIR除了對(duì)腎本身造成損傷外，還可以對(duì)心、肺、腦等遠(yuǎn)隔器官造成損害[2]。RIR過程中所產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物和炎性介質(zhì)，易進(jìn)入血液循環(huán)，從而影響作為遠(yuǎn)隔器官心臟的代謝與功能。心臟血流量大，易受循環(huán)中有害物質(zhì)影響而出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能損傷，其中免疫損傷在腎缺血再灌注后的心肌損傷中起重要作用。研究表明，免疫系統(tǒng)干預(yù)可能對(duì)RIR后心臟有保護(hù)作用。雷帕霉素是一種免疫抑制劑(RAPA)，可以通過受體FK50結(jié)合蛋白12結(jié)合靶標(biāo)(mTOR)[3]，以抑制其信號(hào)傳導(dǎo)，從而減少G1期晚期免疫細(xì)胞的停滯并抑制免疫反應(yīng)。RAPA對(duì)RIR后心臟的保護(hù)機(jī)制仍不清楚。盡管國內(nèi)外諸多學(xué)者在雷帕霉素對(duì)腎臟缺血再灌注損傷方面做了大量的研究工作，但RAPA對(duì)RIR后心臟的保護(hù)機(jī)制仍不清楚。因此，我們對(duì)RAPA對(duì)RIR后心臟的保護(hù)作用進(jìn)行了探討，以期從免疫反應(yīng)角度尋找減輕RIR后心臟損傷的方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD健康雄性大鼠40只，體重20～25 g(誤差不大于10%)，周齡:8～9周，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心技術(shù)有限公司[SCXK(京)2017-0001]，在唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[SYXK(冀)2015-0038]完成實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2017080)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

全自動(dòng)生化分析儀及流式細(xì)胞儀均購自美國加利福尼亞州Beckman Coulter公司；生化檢測試劑盒由南京建成生物制品公司提供，實(shí)驗(yàn)方法參見試劑盒說明；高倍率顯微鏡購自日本東京奧林巴斯公司；TUNEL試劑盒購自武漢博斯特生物科技有限公司；二抗購自北京中山生物技術(shù)公司；RT-qPCR所用試劑盒購自中國大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物的處理

大鼠分為4組:(1)空白組:10只，常規(guī)飼養(yǎng)3 d。(2)假手術(shù)組:10只，常規(guī)飼養(yǎng)3 d。(3)RIR組:10只，常規(guī)飼養(yǎng)3 d。(4)雷帕霉素處理組:10只，每日灌胃給予雷帕霉素(4.5 mg/(kg/d))，持續(xù)3 d。

1.3.2 動(dòng)物模型復(fù)制

大鼠稱重后用3%戊巴比妥鈉溶液(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，然后開腹，找出左右兩側(cè)腎動(dòng)、靜脈后夾閉，45 min后恢復(fù)血流供應(yīng)，復(fù)制大鼠腎缺血再灌注模型。操作中腎由紅變白再由白變紅，認(rèn)為經(jīng)歷了缺血再灌注過程，術(shù)后逐層縫合。假手術(shù)組除不夾閉雙側(cè)腎動(dòng)、靜脈外，其余操作同RIR組。雷帕霉素處理組經(jīng)灌胃給藥飼養(yǎng)3 d后再經(jīng)歷手術(shù)，雷帕霉素處理組的劑量為每天4.5 mg/kg，其余操作處理同RIR組。

1.3.3 樣品采集與檢測

腹主動(dòng)脈取血并留取心臟和脾組織標(biāo)本。取心尖組織經(jīng)HE染色，鏡檢，觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.3.4 指標(biāo)測定及試劑來源

(1)血漿生化指標(biāo)測定

采集腹主動(dòng)脈血3 mL，加肝素，離心，采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測定，連續(xù)監(jiān)測1～3 min觀察吸光度的變化，計(jì)算肌酸激酶和肌酸激酶同工酶的活力值，結(jié)果以103U/L表示。

(2)腎功能

腎灌注后24 h，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血分成兩部分，一部分血液檢測尿素氮，另一部分檢測肌酐。肌氨酸氧化酶法測定肌酐，脲酶法測定尿素氮。

(3)心臟病理損傷的半定量分析

剖開胸腔，取出心臟，洗凈，甲醛固定，脫水浸蠟，石蠟包埋，PAS染色，觀察病理切片并進(jìn)行心臟病理損傷的半定量分析。在高倍率顯微鏡(200×)隨機(jī)地選擇10個(gè)視野，觀察損傷程度。運(yùn)用半定量病理評(píng)估法評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)為:正常為0，損傷＜25% 1分，損傷25%～50% 2分，損傷51%～75% 3分，損傷＞75% 4分。

(4)細(xì)胞凋亡測試

心臟經(jīng)固定過夜，石蠟包埋，依據(jù)熒光及顯色法，在DNA斷裂時(shí)3’-OH暴露被抗熒光素抗體標(biāo)記，經(jīng)過PBS漂洗，水沖洗，用濾紙吸干水分，加樣，在DAB的催化下室溫孵育5～30 min呈棕色，觀察凋亡細(xì)胞狀況并在顯微鏡下拍照保存。根據(jù)TUNEL試劑盒指示說明操作。顯微鏡下的紅色熒光為TUNEL陽性細(xì)胞。隨機(jī)選擇六個(gè)非重復(fù)視野(200×)，凋亡指數(shù)(AI):AI(凋亡計(jì)數(shù)/總細(xì)胞計(jì)數(shù))×100%。

(5)流式細(xì)胞儀

將大鼠的血液，脾和心臟制成單細(xì)胞懸液，在免疫染色之前裂解紅細(xì)胞，用無菌PBS和BSA緩沖液洗滌，加入一抗的重懸細(xì)胞，避光保存，PBS離心洗滌，加入二抗，洗滌，進(jìn)入Cellquest調(diào)整優(yōu)化細(xì)胞流速和濃度，使目標(biāo)細(xì)胞通過進(jìn)樣室的速度為2000/s左右，進(jìn)行細(xì)胞分選，用流式方法檢測分析NKT細(xì)胞。NKT細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)為CD3和NK1.1雙陽性。心臟總RNA用TRIzol提取。純化后，將RNA樣品用于反轉(zhuǎn)錄以合成cDNA。

(6)RT-qPCR檢測VEGF，HIF-1α和CXCL10 mRNA水平。

PCR反應(yīng)中使用的引物為:β-肌動(dòng)蛋白正向，5’-AGGCATCCTGACCCTGAAGTA-3’和反向，5’-GA GGCATACAGGGACAACACACAG-3’；CXCL10正向5’-ACTGCATCCATATCGATGAC-3’和反向5’-TTC ATCCTGCAATGATCTC-3’；HIF-1α正向，5’-AAG TCTAGGGATGCAGCAC-3’，反向，5’-CAAGATCACC AGCATCTAG-3’；VEGF正向?yàn)?’-ATTGAGACCC TGGTGGACATC-3’，反向?yàn)?’-TCCTTTCCTCGA ACTGATT-3’。使用2-ΔΔCq方法將每個(gè)基因的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)源性對(duì)照β-肌動(dòng)蛋白。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)的形式表示，單因素方差分析q檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理各組之間的差異，以P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生存情況

在實(shí)驗(yàn)過程中，由于損傷缺口小，研究人員能夠迅速找到腎動(dòng)靜脈，進(jìn)行分離夾閉。夾閉時(shí)間45 min較短，因此在恢復(fù)再灌注過程中大鼠一直是存活的。動(dòng)物在麻醉的狀態(tài)下進(jìn)行取材，先抽取腹主動(dòng)脈血液，迅速摘取脾和心臟。

2.2 血漿CK、CK-MB、BUN和Scr水平

與RIR組相比，雷帕霉素處理組血漿中CK、CK-MB水平降低(P＜0.01)。與假手術(shù)組相比，RIR組CK、CK-MB水平升高(P＜0.01)。血漿BUN和Scr水平經(jīng)過再灌注后升高，尤以RIR組與假手術(shù)組相比升高的更明顯(P＜0.01)，見表1。

2.3 HIF-1α，VEGF和CXCL10 mRNA的表達(dá)水平

RIR組HIF-1α和VEGF mRNA的表達(dá)水平高于假手術(shù)組(P＜0.05)，雷帕霉素處理組HIF-1α和VEGF mRNA的表達(dá)水平低于RIR組(P＜0.05)。RIR組中CXCL10 mRNA的表達(dá)水平低于假手術(shù)組(P＜0.05)，雷帕霉素處理組高于RIR組(P＜0.05)，見表2。

2.4 NKT細(xì)胞百分比

RIR組脾中NKT細(xì)胞的百分比低于假手術(shù)組(P＜0.05)，雷帕霉素處理組脾中NKT細(xì)胞的百分比顯著低于RIR組(P＜0.01)。心臟和外周血中NKT細(xì)胞的百分比RIR組高于假手術(shù)組(P＜0.05)，并且雷帕霉素處理組顯著高于RIR組(P＜0.01)，見圖1。

2.5 心肌組織形態(tài)學(xué)變化

空白組和假手術(shù)組大鼠的心肌細(xì)胞大小、形態(tài)均正常。RIR組:心肌纖維紊亂，間質(zhì)腫脹，炎性細(xì)胞浸潤。雷帕霉素處理組:心肌纖維排列尚整齊，間質(zhì)腫脹和炎性細(xì)胞浸潤程度較RIR組有所減輕，見圖2。

3 討論

腎缺血再灌注損傷是腎血液不足，恢復(fù)血液循環(huán)灌注后其功能損傷反而加重，組織結(jié)構(gòu)無法恢復(fù)正常的一種病理生理狀態(tài)。炎性細(xì)胞因子和氧自由基除對(duì)腎本身造成損傷外[4-6]，還對(duì)心臟、肺、肝等遠(yuǎn)隔器官造成損傷，尤其是需氧、需血量極大的心臟。在腎缺血再灌注到心肌損害過程，免疫反應(yīng)是重要反應(yīng)之一。缺血再灌注損傷作為一個(gè)非免疫性因素能通過免疫機(jī)制影響心臟的損傷程度[7]。

雷帕霉素是一種新型免疫抑制劑，可通過受體FK50結(jié)合蛋白-12與靶蛋白(mTOR)結(jié)合，抑制其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而減少晚期G1期免疫細(xì)胞的停滯，抑制免疫應(yīng)答。免疫抑制劑可以通過抑制炎癥反應(yīng)從而減輕缺血再灌注后對(duì)組織器官的損害[8]。據(jù)報(bào)道雷帕霉素經(jīng)過非直接通路方式使激活的T細(xì)胞凋亡，通過阻礙抗原呈遞過，抑制DC細(xì)胞成熟，使細(xì)胞因子的分泌減少，阻止DC在心肌組織遷移集聚，可以明顯改善大鼠RIR后心臟的結(jié)構(gòu)和生理功能[9]。

表1 各組血漿中CK，CK-MB，BUN和Scr含量變化(±s，n＝10)Table 1 Values of CK，CK-MB，BUN and Scr in different groups

表1 各組血漿中CK，CK-MB，BUN和Scr含量變化(±s，n＝10)Table 1 Values of CK，CK-MB，BUN and Scr in different groups

注:與假手術(shù)組比，△△P＜0.01；與RIR組比，*P＜0.05，**P＜0.01。Note.Compared with the Sham group，△△P＜0.01.Compared with the RIR group，*P＜0.05，**P＜0.01.

分組Groups CK 103 U/L CK-MB 103 U/L BUN mg/dL Scr mg/dL空白組Control group 0.49±0.04 0.75±0.07 157.80±10.62 7.90±0.60假手術(shù)組Sham group 0.61±0.05 0.88±0.13 163.60±12.26 8.10±0.70 RIR組RIR group 11.05±1.46△△ 14.31±2.09△△ 701.40±60.45△△ 21.50±2.10△△RAPA+RIR組RAPA+RIR group 9.32±1.33** 11.22±1.95** 340.30±31.02* 14.20±1.30*

表2 CXCL10、HIF-1α和VEGF mRNA在不同組中的表達(dá)水平(±s，n＝10)Table 2 Expression levels of CXCL10，HIF-1αand VEGF mRNA in the different groups

表2 CXCL10、HIF-1α和VEGF mRNA在不同組中的表達(dá)水平(±s，n＝10)Table 2 Expression levels of CXCL10，HIF-1αand VEGF mRNA in the different groups

注:與假手術(shù)組對(duì)比，△P＜0.05；與RIR組對(duì)比，*P＜0.05。Note.Compared with the Sham group，△P＜0.05.Compared with the RIR group，*P＜0.05.

組別Groups HIF-1α VEGF CXCL10空白組Control group 0.0115±0.005 0.0159±0.0013 0.4839±0.041 RIR組RIR group 0.0167±0.008△ 0.0201±0.0016△ 0.2753±0.028△RAPA+RIR組RAPA+RIR group 0.0139±0.007* 0.0187±0.0015* 0.3349±0.037*

注:與假手術(shù)組相比，△P＜0.05；與RIR組相比，**P＜0.01。圖1 各組小鼠脾、心臟及外周血中NKT細(xì)胞百分比Note.Compared with the Sham group，△P＜0.05.Compared with the RIR group，**P＜0.01.Figure 1 Percentage of NKT cells in spleen，heart and peripheral blood of mice in each group

注:a:空白組；b:假手術(shù)組；c:RIR組；d:RAPA+RIR組。圖2 四組心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究Note.a，Control group.b，Sham group.c，RIR group.d，RAPA+RIR group.Figure 2 Myocardia morphology among four groups

心臟運(yùn)轉(zhuǎn)過程需氧量大，容易被RIR過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)所損傷。心肌受損傷時(shí)會(huì)促進(jìn)CK、CK-MB等因子釋放，其釋放量入血越多，心肌病變程度越高。因此，血清心肌酶活性的測定可用來體現(xiàn)心肌細(xì)胞損傷程度[10]。氧化應(yīng)激使細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，CK、CK-MB滲出增加，其在血清中的含量大幅度提高[11]。在本研究中，與假手術(shù)組比較，RIR組損傷水平顯著加劇。與RIR組相比，雷帕霉素處理組損傷程度減輕。該結(jié)果與Feng等[12]人在2018年內(nèi)的研究結(jié)果相符，表明雷帕霉素能夠減少氧化應(yīng)激對(duì)心肌的損傷、降低心肌細(xì)胞膜的通透性，從而起到對(duì)RIR致心肌損傷的保護(hù)作用。

腎缺血再灌注損傷產(chǎn)生的炎癥因子以及低氧誘導(dǎo)因子可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。因此推斷心肌細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致心肌損傷的原因之一。RIR時(shí)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增高。相較RIR組，雷帕霉素處理組細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著減少。該結(jié)果顯示RIR后心肌組織受損明顯，而處理雷帕霉素對(duì)RIR后的心肌損傷起保護(hù)作用[13]。

趨化因子CXC亞家族，如CXCL10，其特殊作用于NK細(xì)胞表面受體。可趨化單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、和自然殺傷(NK)細(xì)胞等進(jìn)入炎癥部位，介導(dǎo)缺血后再灌注產(chǎn)生的遠(yuǎn)隔器官損害[14]。RIR迅速激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)[15]。在趨化因子的作用下，心肌中集聚的CD4+T細(xì)胞逐漸增多。這些趨化因子可能通過正反饋促進(jìn)自身的分泌，形成有效的濃度梯度，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的浸潤，從而放大這一免疫反應(yīng)過程。使得心肌組織受損程度增加。結(jié)果表明，相比于RIR組，假手術(shù)組心肌組織中的CXCL10含量顯著增加，雷帕霉素處理組含量升高且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與Zhang等[3]人在2018年的研究結(jié)果一致。這說明正常機(jī)體CXCL10也有表達(dá)，RIR時(shí)，機(jī)體消耗大量趨化因子來介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的活化，導(dǎo)致自身含量的減少。雷帕霉素處理組其含量有所增加，表明機(jī)體的免疫反應(yīng)受到了雷帕霉素的抑制，使得對(duì)心肌細(xì)胞有損害的CD4+T細(xì)胞數(shù)量的減少，所需要的趨化因子數(shù)量也減少，因此，CXCL10的數(shù)量有所上升。這說明在RIR后心肌損傷加重，而雷帕霉素可緩解大鼠心肌受損，發(fā)揮對(duì)心肌顯著的保護(hù)作用。

NKT細(xì)胞包括CD3和NK1.1雙陽性細(xì)胞，它是一種免疫細(xì)胞，其在TCR受到刺激后1～2 h內(nèi)被激活，迅速產(chǎn)生多種類型的細(xì)胞因子[16-18]。研究表明，NKT細(xì)胞在缺血后再灌注導(dǎo)致的損傷過程中扮演重要角色。其中NKT細(xì)胞可以通過外周血從脾中募集到靶器官。為保護(hù)機(jī)體，免疫系統(tǒng)中的NKT細(xì)胞可以通過分泌Th2型細(xì)胞因子IL-10發(fā)揮抑制免疫細(xì)胞的作用，降低T細(xì)胞在RIR時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞的損害作用。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，脾中NKT細(xì)胞百分比呈逐漸下降趨勢(shì)，心臟和外周血NKT細(xì)胞百分比呈逐漸上升趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果與Pan等[19]人在2019年的研究結(jié)果一致。這說明，機(jī)體在受到炎癥反應(yīng)時(shí)，可本能地刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)進(jìn)行自我保護(hù)。RIR對(duì)機(jī)體造成損害，激發(fā)了機(jī)體自身的保護(hù)機(jī)制。RIR后心肌組織損害程度加重，在給予雷帕霉素后，心肌損傷有所好轉(zhuǎn)?？赡軝C(jī)制是雷帕霉素上調(diào)CXCL表達(dá)水平，促進(jìn)NKT細(xì)胞聚集增多，使得外周血和心臟組織NKT細(xì)胞的正反饋集聚增加，因此使再灌注后的心肌受損減輕[11]。

缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)，是一種調(diào)控靶基因、缺氧適應(yīng)和炎癥的轉(zhuǎn)錄活性核蛋白。它主要由在細(xì)胞中參與生長發(fā)育調(diào)節(jié)的兩個(gè)亞基構(gòu)成，HIF-1α主要參與缺氧反應(yīng)應(yīng)答；而HIF-1β的功能是穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。HIF-1a對(duì)氧濃度敏感，在RIR的條件下，由于機(jī)體缺血缺氧，HIF-1α的降解途徑阻斷(VHL蛋白能識(shí)別并與其形成復(fù)合物，阻止HIF-1α的降解作用)，導(dǎo)致HIF-1α的mRNA含量上調(diào)。HIF-1α在中間區(qū)域與HIF-1β發(fā)生結(jié)合，產(chǎn)生異二聚體，正反饋調(diào)節(jié)VEGF mRNA表達(dá)，改善血管通透性[20]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，VEGF和HIF-1α的表達(dá)水平在RIR組和雷帕霉素處理組高于假手術(shù)組(P＜0.05)，雷帕霉素處理組和RIR組相比VEGF和HIF-1αmRNA水平明顯降低(P＜0.05)。該結(jié)果與伊利亞爾等[21]的研究結(jié)果一致。說明在RIR后心臟受到損傷，機(jī)體啟動(dòng)免疫反應(yīng)，激活血管新生信號(hào)通路，上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，這一過程導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)心肌供血供氧以對(duì)抗RIR后心肌損傷[20-22]。而雷帕霉素給藥干預(yù)后，其藥物可以使乳酸含量增高，促進(jìn)無氧代謝活動(dòng)，短時(shí)間弱化心肌需氧量，導(dǎo)致HIF-1αmRNA表達(dá)下調(diào)。

VEGF mRNA可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活性氧自由基生成，在氧化應(yīng)激中促進(jìn)細(xì)胞凋亡，引起炎癥發(fā)生[23-24]。白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在炎癥因子作用下粘附聚集而發(fā)生炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致微循環(huán)障礙。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，相比于假手術(shù)組，RIR組的心肌細(xì)胞中VEGF mRNA水平顯著上調(diào)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與RIR組相比，雷帕霉素處理組VEGF mRNA水平下調(diào)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與Zhang等[3]人在2018年的研究結(jié)果一致。雷帕霉素給藥后，能夠通過抑制mTOR通路，進(jìn)而抑制HIF-1α表達(dá)，最終導(dǎo)致VEGF表達(dá)量下降[25]。雷帕霉素對(duì)心肌的保護(hù)作用，可能與減少VEGFmRNA的表達(dá)，從而減少活性氧自由基的生成有關(guān)。

綜上所述，雷帕霉素可減輕RIR大鼠心肌損傷。作用機(jī)制可能與增加NKT細(xì)胞數(shù)量，抑制HIF-1α和VEGF的表達(dá)，上調(diào)CXCL10的表達(dá)，從而增強(qiáng)RIR后心臟的抗炎、抗凋亡作用有關(guān)。