氧化應(yīng)激損傷中NKFB1基因多態(tài)性對細(xì)胞凋亡的影響

周韻

摘 要：目的：人原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HuvECs）通過氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)從而建立體外氧化應(yīng)激損傷模型，觀測NF-κB1基因啟動(dòng)子區(qū)-94號位點(diǎn)ATTG插入/缺失（rs28362491，-94ins/del ATTG）對細(xì)胞凋亡的影響。方法：檢測ox-LDL對細(xì)胞活性影響的適宜時(shí)間及濃度，并通過ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs建立氧化應(yīng)激損傷模型，通過Western blot法分別檢測空白對照組及ox-LDL誘導(dǎo)組NFKB1不同基因型的細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示：HuvECs通過100umol/L ox-LDL誘導(dǎo)12h細(xì)胞活力即可顯著降低;Western blot檢測結(jié)果顯示：ox-LDL可誘導(dǎo)HuvECs發(fā)生細(xì)胞凋亡，且DD型凋亡水平較II型顯著增高。結(jié)論：ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs可促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，且NFKB1不同基因型中細(xì)胞凋亡水平具有顯著差異。

關(guān)鍵詞：NFKB1;氧化應(yīng)激;冠心病;凋亡

1 研究背景

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary artery disease，冠心?。┦?0歲以上人群的首要死亡原因。炎癥反應(yīng)是冠心病發(fā)生發(fā)展的核心機(jī)制，其中NF-κB信號通路處于炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，因而冠心病的發(fā)生發(fā)展與NF-κB1基因啟動(dòng)子區(qū)-94號位點(diǎn)ATTG插入/缺失（rs28362491，-94ins/del ATTG）密切相關(guān)，但多數(shù)研究僅進(jìn)行了大樣本人群篩查工作，并未對其產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探索研究?；诖?，本研究擬通過檢測NF-κB1基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性，觀測不同基因型細(xì)胞間的凋亡水平差異，從而通過篩查個(gè)體基因類型提高冠心病的早期診斷能力，同時(shí)為易感個(gè)體提供個(gè)體化治療，降低其心血管疾病的并發(fā)癥、死亡率提供理論基礎(chǔ)。

2 研究方法

2.1 材料

M199培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自HyClone公司，胎牛血清購買于杭州四季青生物工程系有限公司，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）購自廣州奕源生物科技有限公司，MTT購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司公司，兔抗人BCL-2、BAX抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞取自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

2.2 方法

2.2.1 氧化應(yīng)激損傷模型建立及分組

將HUVEC細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，96孔板5000細(xì)胞/孔進(jìn)行鋪板，分別加入0、50、100、150umol/L ox-LDL刺激HUVEC 0、4、8、12、24h。培養(yǎng)結(jié)束后去除孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入200ul濃度為100ng/ml MTT的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)4h后去除培養(yǎng)基，每孔加入100ul DMSO，震蕩10min后酶標(biāo)儀495nm檢測吸光值。根據(jù)所得數(shù)據(jù)，選擇最適濃度及時(shí)間對不同基因型HUVECs進(jìn)行分組誘導(dǎo)。實(shí)驗(yàn)分為空白組和ox-LDL誘導(dǎo)組，各組再根據(jù)HuvECs的NFKB1基因型分組，分別為：DD型組、II型組。

2.2.2 NFKB1基因多態(tài)性在細(xì)胞凋亡的影響

分別收集四組細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，通過BCA法進(jìn)行蛋白定量檢測。Western Blot法分別檢測凋亡相關(guān)蛋白：BAX、BCL-2表達(dá)水平。電泳中每道蛋白上樣體積為10ul：分別包含蛋白10ug，5×上樣緩沖液2ul，剩余體積用蛋白裂解液補(bǔ)足;結(jié)束后采用電轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上;轉(zhuǎn)模后，50g/L脫脂奶粉室溫封閉2h;0.05ml/L TBST洗膜;再分別加入1∶1000稀釋的兔抗人BAX、BCL-2抗體，4℃孵育過夜;TBST洗膜;加入1∶1000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔二抗，室溫孵育2h;TBST洗膜;加入BCIP/NBT顯色。以BCL-2/BAX的吸光度比值進(jìn)行半定量分析。

3 結(jié)果

3.1 氧化應(yīng)激損傷模型建立

MTT結(jié)果顯示：100umol/L ox-LDL誘導(dǎo)12h可顯著降低細(xì)胞活性，使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷反應(yīng)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采取此誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時(shí)間建立模型。

3.2 NFKB1基因多態(tài)性對細(xì)胞凋亡的影響

Western Blot檢測結(jié)果顯示：各組細(xì)胞蛋白提取物中BAX及BCL-2蛋白均有表達(dá)，且ox-LDL誘導(dǎo)組凋亡水平顯著高于空白對照組，其差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;通過分析ox-LDL誘導(dǎo)組內(nèi)DD型、II型亞組BAX與BCL-2比值結(jié)果發(fā)現(xiàn)：II型HuvECs凋亡水平遠(yuǎn)低于DD型，其差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Western Blot檢測結(jié)果表明：ox-LDL可誘導(dǎo)HuvECs產(chǎn)生凋亡，且NFKB1 II型細(xì)胞凋亡水平顯著低于DD型。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過對HuvECs采用ox-LDL誘導(dǎo)建立體外氧化應(yīng)激損傷模型，在此次基礎(chǔ)上明確了體外氧化應(yīng)激損傷模型中NF-κB1-94ATTG ins/del不同基因型在細(xì)胞凋亡中的影響，其結(jié)果表明：與突變純合子DD型相比，純合子II型具有較低的細(xì)胞凋亡水平。

綜上所述，本研究證實(shí)了氧化應(yīng)激損傷中NFKB1基因多態(tài)性對細(xì)胞凋亡的重要意義，為今后冠心病的早期診斷和個(gè)體化治療提供了理論依據(jù)。

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項(xiàng)目：陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目（18JK0679）