熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化性質及消化產(chǎn)物抗氧化性的影響

李 芳 黃慧敏 尤翔宇 吳 偉 吳曉娟

(中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院;稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室,長沙 410004)

米糠是稻米加工的副產(chǎn)品之一，產(chǎn)量大、營養(yǎng)豐富且極具開發(fā)價值[1]。米糠中含有活性極強的脂肪水解酶，能誘導脂肪水解，導致米糠水解酸??；水解產(chǎn)生的游離脂肪酸在內源脂肪氧合酶的作用下發(fā)生脂質過氧化反應，形成的脂質過氧化產(chǎn)物會進一步誘導米糠蛋白氧化，導致米糠氧化酸敗[2]。蛋白質氧化通常會誘導蛋白質產(chǎn)生共價交聯(lián)聚集體，此類聚集體的形成對蛋白質的功能性質和消化性質影響頗大[3]。過氧自由基是脂質過氧化產(chǎn)物中一種極具代表性的自由基[4]，尤翔宇等[5]研究發(fā)現(xiàn)過氧自由基能促使米糠蛋白氧化并產(chǎn)生結構變化，進而影響米糠蛋白體外胃蛋白酶的消化性質[6]。熱處理在食品工業(yè)中是一種非常重要的加工方式，加熱會導致蛋白質結構改變，導致其消化性質發(fā)生顯著變化，通常熱處理能提高蛋白質的體外消化率[7]。在米糠蛋白的加工過程中，氧化和熱處理是同時存在的，然而氧化和熱處理會對米糠蛋白消化性質產(chǎn)生不同的影響，因此，只有了解二者共同作用對米糠蛋白消化性質產(chǎn)生影響的機理，才能更好地實現(xiàn)米糠蛋白規(guī)?；C合應用?；诖?，本研究以米糠蛋白為實驗原料，選用AAPH有氧熱降解產(chǎn)生的過氧自由基代表米糠酸敗過程中產(chǎn)生的脂質自由基對米糠蛋白進行不同程度的氧化，結合加熱處理氧化米糠蛋白，在胃蛋白酶酶解的基礎上，重點采用胰蛋白酶酶解，探討熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化性質的影響，以期更全面地認識熱處理和氧化過程中蛋白質的變化，同時為米糠的進一步研究及綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂米糠、AAPH、胃蛋白酶(900 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)、肽分子質量標準品(色譜純)、ABTS(分析純)，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

K9840自動凱氏定氮儀、色譜柱TSKgel SW G2000 SWXL(300 nm×7.8 nm)、LC-20液相色譜儀、BlueStar紫外可見分光光度計。

1.3 試驗方法

1.3.1 米糠蛋白的制備

以脫脂米糠為原料，參考蔡勇建等[8]方法，按照1∶10(g∶mL)的料液比將脫脂米糠與去離子水混合后置于40 ℃條件下攪拌提取4 h，期間用2 mol/L NaOH調pH值至9.0，攪拌結束后離心20 min(4 ℃，8 000 r/min)，用2 mol/L HCl將上清液的pH調至4.0以沉淀蛋白，靜置一段時間后離心15 min(4 ℃，8 000 r/min)，用少量去離子水溶解沉淀并將pH調到7.0，最后冷凍干燥制得純度為83.75%的米糠蛋白。

1.3.2 過氧自由基氧化米糠蛋白的制備

參考尤翔宇等[5]方法，用含0.5 mg/mL NaN3的0.01 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液溶解1.3.1中制得的米糠蛋白粉末得到10 mg/mL的蛋白溶液，往該混合液中添加一定量的AAPH使其濃度為0、0.1、1、3、6和10 mmol/L，在37 ℃下攪拌反應24 h。隨后將溶液裝入潔凈的透析袋，透析24 h除去殘留的AAPH，冷凍干燥后得到過氧自由基氧化米糠蛋白。

1.3.3 熱處理過氧自由基氧化米糠蛋白的制備

用去離子水溶解1.3.2中的過氧自由基氧化米糠蛋白得到2%的蛋白溶液，分兩組。其中一組在37 ℃水浴30 min，另一組在95 ℃水浴30 min，然后將兩組溶液放置在37 ℃下水浴15 min，備用。

1.3.4 米糠蛋白體外胰蛋白酶消化率的測定

參考Chen等[9]方法，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶兩步酶解法處理過氧自由基氧化米糠蛋白。取1.3.3中樣品，在37 ℃下用2 mol/L HCl將pH調到2.0，加入4 U/mg胃蛋白酶反應1.5 h，2 mol/L NaOH溶液將pH調至7.0，加入4 U/mg胰蛋白酶反應3 h，沸水浴5 min使胰蛋白酶失活，離心10 min(4 ℃，10 000 r/min)后取上清液，采用凱氏定氮法測定上清液的肽濃度。將剩余上清液濃度稀釋至0.6 mg/mL，以測定米糠蛋白胰蛋白酶消化產(chǎn)物分子質量分布和抗氧化性。

1.3.5 米糠蛋白體外胰蛋白酶消化進程的測定

取1.3.3中樣品，用2 mol/L HCl調節(jié)pH值到2.0，加入4 U/mg胃蛋白酶，37 ℃下保溫酶解90 min，用2 mol/L NaOH溶液將消化液pH調至7.0，加入4 U/mg胰蛋白酶，37 ℃下酶解0、10、20、40、60、80、120和180 min后加入三氯乙酸溶液終止反應。隨后離心15 min(4 ℃，8 000 r/min)，取上清液測定OD280值。為表征米糠蛋白體外胰蛋白酶消化進程，參考Bax等[10]方法引入擬合指數(shù)曲線方程和半衰期方程：

1/OD=1/ODmax×eβ(1/t)t1/2=β/ln

(2)

式中：ODmax為完全消化時的最大OD值；β為曲線形狀系數(shù)；t1/2為達到ODmax的一半所需的消化時間。

1.3.6 米糠蛋白體外胰蛋白酶消化產(chǎn)物分子質量測定

參考Chen等[9]方法稍作修改，將肽分子質量標準品配制成1 mg/mL的蛋白溶液，采用高效液相色譜儀分析。取1.3.4中得到的濃度一致的上清液過膜，收集濾液，采用高效液相色譜儀分析樣品。其中色譜柱：TSKgel SW G2 000 SWXL(300 nm×7.8 nm)；檢測器：紫外檢測器；流動相：0.1 mol/L、pH 6.8含0.1 mol/LNa2SO4的磷酸鹽緩沖液；檢測波長：220 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃。將標準品經(jīng)凝膠色譜柱測定，最后得到標準曲線y=-0.237 1x+7.157 7(R2=0.985 6)。

1.3.7 米糠蛋白體外胰蛋白酶消化產(chǎn)物抗氧化活性測定

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有實驗平行測定3次，結果均以“均值±標準偏差”表示。數(shù)據(jù)處理采用Microsoft excel 2007，顯著性分析采用IBM SPSS Statistics 24。采用最小顯著差異法進行指標比較，取95%置信度(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化率的影響

熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化率的影響如圖1所示，隨著AAPH濃度的增加，未熱處理和熱處理的氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化率均先增加后下降，在AAPH濃度為1 mmol/L時分別到達最大值74.12%和81.11%。Zhou等[14]采用亞油酸氧化豬肌原纖維蛋白，結果發(fā)現(xiàn)低濃度的亞油酸有助于增強肌原纖維蛋白的柔性并提高其消化率；而高濃度的亞油酸會誘導肌原纖維蛋白形成聚集體，對胃蛋白酶酶解肌原纖維蛋白產(chǎn)生負面影響。尤翔宇等采用過氧自由基氧化米糠蛋白探究氧化對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化性質的影響[6]，研究結果中胃蛋白酶消化率的變化趨勢與本研究中胰蛋白酶消化率的變化趨勢一致，結合過氧自由基氧化對米糠蛋白結構的影響可以推斷[5]，低濃度的過氧自由基可以使米糠蛋白的空間結構展開，暴露出更多的蛋白酶結合與識別位點，提高米糠蛋白的消化率；而高濃度的過氧自由基則會誘導蛋白質氧化聚集體的形成，掩蔽米糠蛋白中部分蛋白酶的結合與識別位點，導致米糠蛋白消化率下降。同時，與米糠蛋白體外胃蛋白酶消化率相比[6]，本研究中體外胰蛋白酶消化率顯著升高，這可能是由于胰蛋白酶的進一步消化作用。

注：同一柱狀圖中不同字母表示顯著性差異(P<0.05)，下同。圖1 熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化率的影響

與未熱處理相比，熱處理提高了相同氧化程度下米糠蛋白體外胰蛋白酶的消化率。有研究表明，熱處理能提高胰蛋白酶酶解苦蕎蛋白的速度，并改善苦蕎蛋白消化率，原因主要是熱處理使苦蕎蛋白緊密的結構變得疏松，暴露出部分隱藏在苦蕎蛋白內部的胰蛋白酶結合與識別位點[15]。由此推測，在相同氧化程度下，熱處理會使蛋白質的結構展開，改變蛋白質分子酶解位點的數(shù)量，進而改善米糠蛋白的消化率。隨著AAPH濃度的增加，熱處理后氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化率的提升幅度逐漸減小，這可能是因為高濃度的過氧自由基會促進蛋白質分子間通過非二硫鍵的共價交聯(lián)形成氧化聚集體，熱處理難以破壞此類氧化聚集體的結構，使得熱處理提升氧化蛋白消化率的幅度有限[16]。

2.2 熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化進程的影響

未熱處理和熱處理的過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化進程如圖2所示，擬合曲線具體參數(shù)見表1。相同氧化程度下，氧化米糠蛋白OD280值隨消化時間的增加而升高，前80 min增長較快而后逐漸趨于平緩，與尤翔宇等[6]研究過氧自由基氧化對米糠蛋白體外胃蛋白酶消化性質影響得到的OD280值變化趨勢相似。未熱處理和熱處理的氧化米糠蛋白ODmax值具有相同的趨勢：隨著AAPH濃度的增加，ODmax值先增大后減小，在AAPH濃度為1 mmol/L時分別達到最大值0.201和0.227。同未熱處理相比，熱處理顯著提高了相同氧化程度下米糠蛋白的ODmax值。

圖2 熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化進程的影響

為了進一步確定熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化進程的影響，以半衰期t1/2相對應的OD280值計算初始消化速率，結果如圖3。隨著AAPH濃度的增加，氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶初始消化速率先升高后降低，在AAPH濃度為1 mmol/L時分別到達最大值0.230 ΔOD280/h和0.259 ΔOD280/h。該結果與Sun等[17]關于蛋白質氧化程度與蛋白初始消化速率之間關系的研究結果一致。同未熱處理相比，熱處理顯著提高了相同氧化程度下米糠蛋白體外胰蛋白酶初始消化速率。周志紅等[18]研究發(fā)現(xiàn)一定的濕熱處理(80 ℃，30～60 min)能顯著提高大豆分離蛋白體外胰蛋白酶消化的效果，與本實驗結果一致。這表明了氧化和熱處理均會改變米糠蛋白的結構，導致米糠蛋白暴露于微環(huán)境中的蛋白酶結合與識別位點數(shù)目發(fā)生變化，進而影響蛋白質的胰蛋白酶消化進程。

表1 過氧自由基氧化對米糠蛋白體外胰蛋白酶消化進程擬合曲線參數(shù)的影響

圖3 熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶初始消化速率的影響

2.3 熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化產(chǎn)物分子質量分布的影響

熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化產(chǎn)物分子質量分布的影響見表2。從表2可以看出，米糠蛋白胰蛋白酶消化產(chǎn)物分子質量主要分布在1 500 u內，且集中分布于0～500 u之間，與Wattanasiritham等[19]采用胰蛋白酶水解米糠蛋白得到的肽分子質量分布情況類似。隨著AAPH濃度的增加，氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化產(chǎn)物分子質量分布在500～1 500 u內的肽含量呈現(xiàn)先增多后減少的趨勢，在AAPH濃度為1 mmol/L時分別達到最大值4.00%和6.03%。與未熱處理相比較，熱處理提高了相同氧化程度下米糠蛋白胰蛋白酶消化產(chǎn)物分布在500～1 500 u內的多肽含量。姜竹茂等[20]的研究表明，牛乳蛋白消化產(chǎn)物分子質量主要分布在低于1 500 u內，且多肽含量隨熱處理時間的增加而增加。由此推測，經(jīng)過熱處理的過氧自由基氧化米糠蛋白在胰蛋白酶水解作用下會生成更多的低分子質量消化產(chǎn)物。

表2 過氧自由基氧化對米糠蛋白胰蛋白酶消化產(chǎn)物分子質量分布的影響

2.4 熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化產(chǎn)物抗氧化活性的影響

表3 熱處理對過氧自由基氧化米糠蛋白體外胰蛋白酶消化產(chǎn)物抗氧化性的影響

注：同一行不同字母表示顯著性差異(P<0.05)。

3 結論