番茄灰霉病拮抗菌的篩選及其抑制作用研究

王繼元

（天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300000）

1 引言

番茄（Lycopersicon esculentum Mill，茄科）又名西紅柿 ，，作為世界上蔬菜需求中最多的菜品之一，在世界市場上有廣泛的消費群體[1]。同時也是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，因其獨特的風(fēng)味，極高的營養(yǎng)價值，在日常生活中，番茄也可當(dāng)水果食用[2]。

1.1 番茄灰霉病研究狀況

番茄灰霉病（Botrytis cinerea）是令番茄減產(chǎn)的重要病害之一， 特別是早春大棚栽培的番茄， 因常遇低溫高濕的天氣，導(dǎo)致病害嚴(yán)重發(fā)生[3]。隨著現(xiàn)代塑料大棚蔬菜生產(chǎn)的迅速發(fā)展，保護(hù)地蔬菜栽培面積的不斷擴(kuò)大， 此類病害逐年上升， 每年減產(chǎn)20 %- 30 %，嚴(yán)重時可達(dá)50 %。

1.1.1 番茄灰霉病主要病原菌、發(fā)病癥狀和致病因素

番茄灰霉病病原為真菌門（Eumycophyta），半知菌亞門（Deuteromycotina）， 絲 孢 綱（Hyphomycetes）， 叢 梗 孢 目（Moniliales），叢梗孢科，葡萄孢屬（Botrytis cinerea）的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。

番茄灰霉病發(fā)病癥狀為：番茄部分葉、莖、果實都出現(xiàn)病害。葉片的發(fā)病部位成灰褐色“V” 字形病斑，表面生有灰白色的霉層；莖部多發(fā)生在分枝處或基部，有水漬狀斑點或淡褐色大斑，嚴(yán)重的繞莖一周，病枝折斷；果實腐爛，密生灰色霉層，傳播速度快，爛果很多[5]。

1.1.2 番茄灰霉病的防治

國內(nèi)外學(xué)者十分重視番茄灰霉病的防治工作，并做了大量系統(tǒng)的研究[7]，并且在實踐中已取得了一定的進(jìn)展。但是，目前生產(chǎn)上仍然缺乏防治該病的有效辦法?，F(xiàn)在主要使用的防治手段有化學(xué)用藥、物理防治和生物防治?；瘜W(xué)用藥可分為預(yù)防用藥以及治療用藥；物理防治包括種子臭氧滅菌處理、大劑量臭氧空棚滅菌和采用RTBF-300 病害防治機(jī)；生物防治主要利用拮抗微生物對番茄灰霉病發(fā)生前進(jìn)行防治[6]。

1.2 拮抗菌的應(yīng)用及現(xiàn)狀

拮抗菌能夠產(chǎn)生一些拮抗物質(zhì)，比如細(xì)菌素等，這些產(chǎn)生的物質(zhì)能夠抑制或者直接殺死病原微生物。拮抗菌抑制病原微生物的重要機(jī)理之一是其具有抗生作用。目前，抗生素的應(yīng)用比較廣泛，對黃瓜疫病、泡桐腐爛病、楊樹爛皮病和白菜霜霉病等病害有較良好的防治效果。

1.3 本試驗的目的和意義

番茄是世界蔬菜需求量最多的菜品之一，同時也是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。番茄灰霉病會直接導(dǎo)致番茄產(chǎn)量的銳減，利用生物防治手段來防治番茄灰霉病的發(fā)生，有利于生態(tài)環(huán)境的保持以及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，因為生物防治手段是通過利用微生物中具有的拮抗作用來抑制有害菌類發(fā)生，由于利用拮抗作用來防治病害幾乎不產(chǎn)生副作用，不污染環(huán)境，所以利用拮抗菌進(jìn)行生物防治具有較大的應(yīng)用潛力。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2.1.1 土壤樣品采集

本試驗所使用10 個不同地區(qū)所采集的土壤樣品，進(jìn)行番茄灰霉拮抗菌的篩選。

2.1.2 試驗主要試劑及儀器

LB 培養(yǎng)基：

蛋白胨 10 g 酵母粉 5.0 g 氯化鈉（NaCl） 10 g

蒸餾水 1000 ml PH 7.5

混勻后每支試管加入5ml（固體LB 需每100ml 添加1.6g瓊脂粉末）121 ℃高壓滅菌20min

（1）PDB 培養(yǎng)基：

新鮮馬鈴薯 200g 蔗糖 20.0g 蒸餾水 1000ml

混勻后（PDA 培養(yǎng)基需每100ml 添加1.6g 瓊脂粉末）121 ℃高壓滅菌20 min

（2）察氏培養(yǎng)基：

硝酸鈉（NaNO3） 3.0 g 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 1.0 g

七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.5 g 氯化鉀（KCl） 0.5 g

硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O） 0.01 g 蔗糖 30 g

混勻后121 ℃高壓滅菌20 min。

2.2 試驗方法

2.2.1 試驗樣品菌株的分離與純化

采集不同地區(qū)新鮮土樣10 份，采集時注意采集根際土壤，將不同地區(qū)采集圖樣標(biāo)記編號。取各編號土樣1 份，進(jìn)行研磨，至土樣細(xì)膩為止，過400 目篩子，取篩后土樣各0.5 g，溶于含50 ml 0.85 % 生理鹽水的錐形瓶中，用封口膜封上并將其置于180rpm/min 37℃的搖床上20min（使土壤中微生物充分溶于生理鹽水中）。

2.2.2 番茄灰霉病拮抗菌的篩選

將得到的差異菌株，與番茄灰霉病病菌進(jìn)行平板對峙培養(yǎng)試驗。在固體PDA 平板培養(yǎng)基中心接種番茄灰霉菌餅，在四周對稱接種所篩選出的差異菌株（每組三次重復(fù)），每個平板可以接4-6 個點（可接差異菌株），置于真菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察是否存在抑菌圈，篩選出對番茄灰霉具有較明顯拮抗作用的菌株，再單獨進(jìn)行對峙培養(yǎng)。

2.2.3 番茄灰霉病拮抗菌形態(tài)的觀察

相同培養(yǎng)基在相同的培養(yǎng)條件下，不同菌種的生長特性是各自不同的，因此根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色以及生長時間來鑒定菌種。試驗過程中，我們沾取新長出的細(xì)菌的菌體畫線接種于LB 培養(yǎng)基中；真菌挑取菌絲用劃線法接種在PDA 培養(yǎng)基中，將其分別置于細(xì)菌培養(yǎng)箱（29 ℃）和真菌培養(yǎng)箱（25 ℃）中培養(yǎng)，并觀察菌落的特征形態(tài)，記錄數(shù)據(jù)。

2.2.4 番茄灰霉病拮抗菌的分子鑒定

使用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒按照說明步驟進(jìn)行了細(xì)菌株基因組的提取，并將提取所得DNA 模版進(jìn)行電泳檢測。

2.2.5 番茄灰霉拮抗菌的生理生化鑒定

2.2.5.1 唯一碳源利用

選取草酸、半乳糖、核糖、L-樹膠醛糖、淀粉、肌醇、精氨酸、檸檬酸、蔗糖、木糖、麥芽糖、甘露醇、D- 海藻糖、甘露糖、葡萄糖、山梨醇、鼠李糖、果糖、糖原等藥品進(jìn)行碳源利用試驗。

2.2.5.2 糖、醇發(fā)酵產(chǎn)酸

選取木糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、鼠李糖、山梨醇、甘露醇、L- 樹膠醛糖、淀粉、蔗糖、D- 海藻糖、肌醇、果糖、麥芽糖、等藥品進(jìn)行試驗。

2.2.5.3 精氨酸雙水解酶

培養(yǎng)基：蛋白質(zhì) 1.0 g；酚紅 0.01 g；NaCl 5.0 g；瓊脂 6.0 g；L- 精氨酸鹽 10.0 g；K2HPO40.3 g；蒸餾水 1000 ml

調(diào)節(jié)PH 到 7.0-7.2 之間，分裝試管（每支試管5 mL），建立對照組，121 ℃下滅菌20 min。

3 結(jié)果與分析

3.1 試驗土壤樣品中菌株分離、純化

經(jīng)過對土樣的分離及純化，從10 份土壤樣品中分離出差異菌株29 株，其中細(xì)菌25 株，真菌4 株，依次對其進(jìn)行編號。細(xì)菌為：WJY-1 至WJY-25；真菌為WJY-Z1 至WJY-Z4。

3.2 番茄灰霉病拮抗菌的篩選

通過與番茄灰霉病菌對峙培養(yǎng)試驗，篩選得到6 株（編號依 次 為：WJY-1，WJY-2，WJY-3，WJY-7，WJY-8，WJY-9）有拮抗作用的細(xì)菌。注：“＋” 代表陽性，“－” 代表陰性。

4 討論

4.1 番茄灰霉病拮抗菌的篩選

因為使用化學(xué)手段對番茄灰霉病進(jìn)行防治，會產(chǎn)生大量的藥物殘留，破壞生態(tài)環(huán)境等一系列問題。但是使用拮抗細(xì)菌進(jìn)行防治幾乎不會產(chǎn)生這些問題，因此對拮抗菌的研究與應(yīng)用已成為目前研究熱點之一。芽孢桿菌是目前拮抗菌研究的主要菌屬之一，其種類繁多，對外界環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，并可產(chǎn)生抗逆性的芽孢，在其代謝物質(zhì)中有多種的活性抑菌物質(zhì)存在，具有較大的抑菌范圍，對部分農(nóng)作物有一定的促生作用，具有良好的應(yīng)用前景。

4.2 菌種鑒定

傳統(tǒng)的微生物鑒定手段，主要是通過形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合生理生化試驗結(jié)果對細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。但由于微生物種間的差異有時并不顯著，而且在不同的生存環(huán)境下，相似的菌類一樣可能產(chǎn)生不同的生長現(xiàn)象，從而導(dǎo)致不同的生理生化現(xiàn)象，這就造成菌種鑒定中存在誤差。隨著現(xiàn)代的分子生物學(xué)的發(fā)展，可以進(jìn)一步削弱此類問題。

4.3 篩選所得拮抗菌抑病效果

拮抗菌的作用機(jī)理較為復(fù)雜，其與環(huán)境因素存在緊密的關(guān)系，當(dāng)外界環(huán)境不適于其生長時，甚至都不會表現(xiàn)出其拮抗作用甚至死亡。在試驗室充足的環(huán)境條件下單一菌株也會存在易退化現(xiàn)象，單一菌株對環(huán)境適應(yīng)能力較弱，在不同的環(huán)境中往往并不能表現(xiàn)出試驗室內(nèi)的試驗結(jié)果以及現(xiàn)象。

5 結(jié)論

在我國，番茄灰霉病可導(dǎo)致番茄每年減產(chǎn)20 %-30 %，已經(jīng)成為番茄種植過程中面臨的重大問題之一。在蕃茄灰霉病防治過程中，由于拮抗菌防治病害專一性強(qiáng)，無毒害，無污染已在世界范圍廣泛使用。