基于鹽脅迫的苦豆子種子生理特性和賴氨酸脫羧酶基因表達(dá)分析

周玉梅，洪園淑，李文娟，劉 萍*，田 蕾

(1.寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

【研究意義】苦豆子(SophaoraalopecuroidesL.)為豆科槐屬多年生草本根莖地下芽植物，又名苦甘草[1]。主要分布于我國西北部的干旱荒漠地區(qū)[2]。耐鹽堿、抗干旱，也是重要的防風(fēng)固沙和改良鹽堿地的優(yōu)選野生植物[3]。苦豆子具有清熱解毒、抗菌消炎等作用，以氧化苦參堿(oxymatrine，OMA)和苦參堿(matrine，MA)為原料研發(fā)的藥劑主要用于治療慢性乙型病毒性肝炎和婦科霉菌性炎癥[4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】賴氨酸脫羧酶(Lysine decarboxylase，LDC)基因是OMA和MA生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵酶基因[5]，可以催化賴氨酸脫羧生成尸胺(cadaverine, Cad)。楊毅等[6]在苦豆子中克隆獲得了SaLDC，在PEG脅迫下，SaLDC表達(dá)量與OMA含量呈正相關(guān)；陸姍姍等[7]通過步移法獲得SaLDC上游1260 bp的啟動(dòng)子序列，生物信息學(xué)分析顯示，該啟動(dòng)子序列中含有逆境應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件；劉丹等[8]和段啟榮等[9]用PEG模擬干旱條件脅迫苦豆子種子和幼苗，研究表明適度干旱有助于苦豆子種子的萌發(fā)，萌動(dòng)種子對(duì)干旱有較強(qiáng)的防御機(jī)制，苦豆子幼苗對(duì)干旱脅迫也具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力；苗永美等[10]利用RT-PCR技術(shù)從耐冷黃瓜品種中克隆獲得了CsLDC，通過qRT-PCR證明該基因受低溫和鹽脅迫的誘導(dǎo)而表達(dá)；張吉順等[11]采用同源克隆和RT-PCR技術(shù)在煙草中克隆獲得NtLDC1，qPCR表明低溫可以誘導(dǎo)NtLDC1的表達(dá)。Bunsupa等[5]將羽扇豆的La-L/ODC轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥和煙草后發(fā)現(xiàn)其Cad含量增加；Kuznetsov等[12]將冰葉日中花用不同濃度的NaCl溶液處理后發(fā)現(xiàn)葉片中LDC活性提高,且Cad含量增加。目前，對(duì)鹽脅迫條件下苦豆子耐鹽相關(guān)的生理特性變化研究很少，SaLDC對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制更是鮮有報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究利用NaCl模擬鹽害環(huán)境，探索苦豆子種子在鹽害條件下，種子萌發(fā)時(shí)的耐鹽閾值和耐鹽相關(guān)的生理特性、SaLDC的基因表達(dá)以及與直接產(chǎn)物Cad含量的變化,旨在揭示苦豆子種子萌發(fā)過程中對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的生理特性變化規(guī)律、SaLDC的表達(dá)與Cad含量之間的關(guān)系。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究苦豆子的耐鹽機(jī)制和SaLDC的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，也為人工植播栽培苦豆子提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

苦豆子莢果采自寧夏永寧縣楊和鄉(xiāng)(東經(jīng)106.144°，北緯38.138°)，由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院李小偉副教授鑒定。室內(nèi)自然干燥后脫粒，精選飽滿的種子，用98 % H2SO4處理以破除硬實(shí)，清水反復(fù)沖洗晾干后備用。

1.2 種子萌發(fā)

用濃度為100、200、300 mmol·L-1的NaCl溶液模擬鹽脅迫，以蒸餾水為對(duì)照脅迫苦豆子種子，脅迫時(shí)間為7 d，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。各處理隨機(jī)取55粒種子于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿(φ = 15 cm)內(nèi)，加入10 mL相應(yīng)的脅迫溶液25 ℃恒溫培養(yǎng)，每12 h更換脅迫溶液1次。種子發(fā)芽指標(biāo)測定參照《種子學(xué)》[13]包括發(fā)芽勢、發(fā)芽率、鮮重和胚根長。分別計(jì)算發(fā)芽指數(shù)(GI)、活力指數(shù)(VI)、簡化活力指數(shù)(SVI)和相對(duì)鹽害率。脅迫結(jié)束后迅速剝?nèi)∽尤~測定相對(duì)質(zhì)膜透性，剩余的子葉、下胚軸和胚根，一部分105 ℃殺青30 min后，85 ℃恒溫烘干，粉碎后過60目篩用于檢測Cad含量，另一部分液氮速凍后-80 ℃保存，進(jìn)行相應(yīng)生理指標(biāo)測定和SaLDC的qPCR分析。

GI=Σ(Gt/Dt)

式中，Gt表示第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt表示相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

VI=S×GI

式中，S為第7天胚根長總和的平均值，GI為發(fā)芽指數(shù)。

SVI=G×S

式中，G為發(fā)芽率，S為第7天胚根長總和的平均值[14]。

相對(duì)鹽害率(%)=(對(duì)照發(fā)芽率-鹽處理發(fā)芽率)/對(duì)照發(fā)芽率×100[15]。

1.3 生理活性測定方法

質(zhì)膜相對(duì)透性(plasma membrane permeability,PMP)采用電解質(zhì)外滲量法[16]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[16]，脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮顯色法[16]，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法[16]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[17]；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法[16]。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.4 尸胺提取和含量測定

尸胺提取和衍生化：準(zhǔn)確稱取苦豆子粉末0.10 g，加入0.4 mol·L-1高氯酸2.0 mL，黑暗靜置15 h，超聲10 min，10 000 r/min離心10 min。吸取上清液0.5 mL，加0.9 mL飽和碳酸鈉溶液和0.5 mL·10 g·L-1丹磺酰氯(Sigma公司)，渦旋混勻，于40 ℃避光振搖1 h后，加100 μl氨水終止反應(yīng)，用1.0 mL乙腈(色譜純,Fisher 公司)萃取目標(biāo)物，6000 r/min離心5 min，上層液過0.22 μm濾膜后得到待測樣品。

Agilent 1220 Infinity Ⅱ LC 高效液相色譜儀進(jìn)行尸胺含量的測定。色譜條件：參考王燕華等[18]方法并稍加修改，色譜柱ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測波長254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量50 μl，流動(dòng)相乙腈∶水(0.7∶0.3)，流速為1.0 mL/min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：準(zhǔn)確稱取尸胺二鹽酸鹽(Sigma公司)5.55 mg，以0.1 mol/L鹽酸溶解并定容。衍生、進(jìn)樣，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣量0.1、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0 μl為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，得到尸胺的線性回歸方程及其線性相關(guān)系數(shù)：Y=557.62X+1.9462，R2=1.0000；用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算樣品尸胺含量。

表1 NaCl脅迫對(duì)苦豆子種子萌發(fā)的影響

1.5 總RNA提取、cDNA第一鏈合成和qRT-PCR

取-80 ℃保存的苦豆子樣品按試劑盒(TRlzol Invitrogen，北京天根生化科技有限公司)說明提取RNA，1.2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量合格后，按照試劑盒說明書(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。根據(jù)已獲得SaLDC的序列，參照楊毅等[6]設(shè)計(jì)的引物，在AnalyticyenaqTOWER3G熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)采用20 μl體系：2×UltraSYBR Mixture 10 μl，F(xiàn)orward Primer(10 μM) 1 μl，Reverse Primer(10 μM) 1 μl，Template cDNA1 μl，ddH2O 7 μl。擴(kuò)增程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。按照2-△△CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[19]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖，利用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫對(duì)苦豆子種子萌發(fā)的影響

由表1顯示，隨NaCl濃度的增加，苦豆子種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、簡化活力指數(shù)、胚根長和鮮重均呈降低趨勢，相對(duì)鹽害率上升(表1)，各處理間差異顯著。當(dāng)NaCl濃度為200 mmol·L-1時(shí)，種子的各項(xiàng)活力指標(biāo)與對(duì)照相比極顯著下降，發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別為2.42 %和63.64 %，相對(duì)鹽害率為32.59 %；當(dāng)NaCl濃度升至300 mmol·L-1時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)一步下降，相對(duì)鹽害率上升至75.59 %?？梢姛o論是苦豆子的各項(xiàng)活力指標(biāo)、還是鹽害率，都表現(xiàn)出隨著NaCl濃度升高，種子萌發(fā)受到的影響越大，200 mmol·L-1的NaCl濃度可以被確定為苦豆子種子萌發(fā)時(shí)的耐鹽閾值。

2.2 NaCl脅迫對(duì)苦豆子種子耐鹽生理特性的影響

由表2顯示，苦豆子種子在NaCl溶液脅迫下，PMP、Pro和MDA含量、POD、SOD和CAT酶活性均發(fā)生相應(yīng)的變化。隨NaCl濃度的增加，萌發(fā)種子子葉中PMP、Pro含量和CAT酶活性表現(xiàn)為上升，MDA含量、POD和SOD酶活性表現(xiàn)為下降。分析發(fā)現(xiàn)輕度鹽脅迫(NaCl溶液≤100 mmol·L-1)就足以引起Pro含量、POD和CAT酶活性的顯著提高(P<0.05)，尤其是POD酶活性驟然升高至CK的3.9倍，表明苦豆子種子對(duì)鹽脅迫反應(yīng)靈敏，低濃度的鹽溶液就足以引起其自身保護(hù)性物質(zhì)Pro含量的極顯著增加和保護(hù)酶POD與CAT活性的極顯著或顯著上升，有效保護(hù)細(xì)胞膜不受傷害以減少鹽溶液對(duì)種子萌發(fā)的影響。中度鹽脅迫(100 mmol·L-1< NaCl溶液≤200 mmol·L-1)下，Pro和MDA含量及CAT酶活性與輕度鹽脅迫差異不顯著，但POD和SOD酶活性均顯著下降。重度鹽脅迫(NaCl溶液>200 mmol·L-1)下，PMP、Pro含量和CAT酶活性極顯著上升(P<0.01)，相反MDA含量、SOD和POD酶活性卻下降至最低，與CK相比差異極顯著。

2.3 苦豆子種子中賴氨酸脫羧酶基因(SaLDC)對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)

qRT-PCR分析表明，無論是對(duì)照還是鹽脅迫7 d的苦豆子種子，SaLDC在種子各組織中均有表達(dá)，且以子葉中表達(dá)量最高，下胚軸中表達(dá)量最低；由圖1可見，鹽脅迫有助于在種子萌發(fā)過程誘導(dǎo)各組織中SaLDC的表達(dá)。經(jīng)輕、中度鹽脅迫后，子葉中SaLDC表達(dá)量和CK差異不顯著，但重度鹽脅迫后SaLDC表達(dá)量驟然上升，是CK的19.8倍；下胚軸是種子中SaLDC表達(dá)量最低的組織，但它對(duì)鹽脅迫表現(xiàn)最為敏感，100～200 mmol·L-1的輕中度的鹽脅迫即可引起表達(dá)量上調(diào)，重度鹽脅迫后其表達(dá)量下調(diào)，是中度脅迫的37.17 %，但依然高于CK；胚根對(duì)低鹽脅迫不敏感，其SaLDC表達(dá)量與CK基本相同，但重度鹽脅迫時(shí)表達(dá)量迅速上調(diào)，是對(duì)照的2.9倍。

表2 NaCl脅迫對(duì)苦豆子種子耐鹽生理特性的影響

圖柱上不同大小寫字母表示在0.01和0.05水平差異顯著

2.4 NaCl脅迫后苦豆子種子中尸胺含量的變化

經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，無論是NaCl脅迫還是未經(jīng)NaCl脅迫的苦豆子種子子葉中均無Cad存在，Cad只存在于下胚軸和胚根中，且隨脅迫濃度的增加Cad含量極顯著下降，此外，分析發(fā)現(xiàn)除重度脅迫外，胚根中Cad含量均高于下胚軸，在300 mmol·L-1NaCl重度脅迫下，胚根中Cad含量為0(表3)。

3 討 論

鹽脅迫對(duì)種子萌發(fā)的影響程度與鹽分的種類、濃度及植物自身的耐鹽能力有關(guān)[20]。本研究表明,不同濃度NaCl溶液對(duì)苦豆子種子萌發(fā)均有抑制作用，隨NaCl溶液濃度的增加，種子萌發(fā)的各項(xiàng)指標(biāo)、胚根長、鮮重均降低,相對(duì)鹽害率呈上升趨勢；當(dāng)鹽濃度達(dá)到300 mmol·L-1時(shí)，種子的發(fā)芽率僅為23.03 %，遠(yuǎn)低于種子正常發(fā)芽率50 %的閾值，因此，200 mmol·L-1NaCl濃度可以看作是維持苦豆子種子正常萌發(fā)的耐鹽閾值。

植物在逆境條件下，體內(nèi)Pro等滲透性調(diào)節(jié)物的積累能夠有效減緩NaCl脅迫對(duì)其造成的傷害[21]，

表3 NaCl脅迫下苦豆子種子不同組織中Cad含量的變化

SOD、POD和CAT抗氧化酶能有效消除活性氧自由基，防止細(xì)胞膜被氧化破壞[22]，在植物抗逆生理中有重要作用。劉丹等[8]用PEG模擬干旱條件脅迫苦豆子種子，發(fā)現(xiàn)在輕度脅迫(PEG≤20 %)時(shí)POD酶起主要作用，重度脅迫(PEG>20 %)時(shí)CAT和SOD酶起主要作用；周麗等[23]對(duì)銀柴胡葉片SOD、POD和CAT酶活性研究后認(rèn)為這3種酶均隨著NaCl脅迫程度的增加，酶活性先升高后降低。本研究發(fā)現(xiàn)苦豆子種子在受到輕度鹽脅迫時(shí)，子葉中Pro含量、CAT和POD保護(hù)酶活性顯著或極顯著高于CK，是此時(shí)抵御鹽脅迫的主要保護(hù)性物質(zhì)，能維持細(xì)胞內(nèi)基本正常的滲透壓，以降低NaCl脅迫對(duì)自身的傷害，中度脅迫下，POD和CAT的酶活性還能保持在較高水平，然而在重度鹽脅迫下子葉中POD和SOD酶活性已降至最低值，只有 CAT酶還保持比較高的活性，成為抵抗高鹽的主要保護(hù)酶，但此時(shí)高濃度鹽溶液的脅迫壓力已超過了各滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護(hù)酶系統(tǒng)的調(diào)節(jié)范圍，質(zhì)膜透性和部分保護(hù)酶系統(tǒng)遭到破壞，導(dǎo)致種子在萌發(fā)過程中受到嚴(yán)重傷害，因而相對(duì)鹽害率極顯著上升。由此進(jìn)一步說明對(duì)苦豆子而言，能使種子在萌發(fā)期耐受NaCl溶液脅迫、正常萌發(fā)的耐鹽閾值應(yīng)為200 mmol·L-1。當(dāng)植株受到外界逆境條件脅迫時(shí)，植株體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生某些特異表達(dá)的基因[24]。楊毅等[25]研究發(fā)現(xiàn)苦豆子幼苗葉片SaLDC表達(dá)受干旱脅迫的調(diào)控，尤其在重度脅迫下表達(dá)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)苦豆子種子無論是未經(jīng)鹽脅迫還是經(jīng)鹽脅迫后，SaLDC在種子各組織中的表達(dá)均有差異，表明苦豆子種子各組織中SaLDC參與了對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)且存在組織表達(dá)特異性。Aziz等[26]對(duì)油菜進(jìn)行PEG滲透脅迫后發(fā)現(xiàn)葉片中Cad含量增加；Kuznetsov等[12]研究發(fā)現(xiàn)冰葉日中花在受到NaCl處理時(shí)，葉片內(nèi)Cad含量也增加。本研究發(fā)現(xiàn)苦豆子子葉中沒有Cad，但在下胚軸和胚根中檢測到高濃度的Cad，此結(jié)果與Scoccianti等[27]對(duì)大豆種子的研究結(jié)果相一致。Villanueva等[28]發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)和幼苗生長過程中，多胺生物合成主要發(fā)生在胚軸中，Lin等[29]發(fā)現(xiàn)在大豆種子萌發(fā)過程中下胚軸和胚根在生長早期合成和積累了大量的Cad和腐胺(Putrescine，Put)，其合成的大多數(shù)氨基酸前體是由子葉蛋白分解提供的。本研究NaCl脅迫使下胚軸和胚根中Cad含量下降，可能與NaCl脅迫促使種子在萌發(fā)過程中加速消耗部分Cad以減少對(duì)其生長的影響有關(guān)，其原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

苦豆子種子能耐受一定濃度的NaCl溶液脅迫，保證種子在NaCl溶液中正常萌發(fā)的閾值是200 mmol·L-1；SaLDC具有組織表達(dá)特異性，鹽脅迫有助于誘導(dǎo)該基因的表達(dá)；子葉中未檢測到Cad，下胚軸和胚根中Cad含量隨NaCl濃度增加而下降。