紅參對乳酸菌體外增菌的影響

鄒美娟 孫永勝 李 晨 康紅艷 王妙姝 田洪濤，2*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院 河北保定071001 2 國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 河北保定071001 3 河北新希望天香乳業(yè)有限公司 河北保定071001）

越來越多的研究表明，腸道微生物群快速、高精確地對飲食、抗生素、環(huán)境、精神壓力等外界刺激產(chǎn)生反應，與人體肥胖、精神類、代謝類和免疫類等疾病息息相關(guān)[1]。食用益生菌和益生元能增強腸道中有益的共生群體，達到增強人體免疫力的效果[2]，然而益生菌進入消化道，需要克服胃酸消化、定植力以及存活率等棘手問題[3]。比較而言，益生元是不可消化的膳食多糖，當外部供應時可以促進遺傳性腸道微生物或益生菌的生長[4]，因此對益生元的研究非常有意義。Ramirez-Farias 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，菊粉的攝入刺激了青春雙歧桿菌的生長；Cani 等[6-7]發(fā)現(xiàn)，向HFD 小鼠喂養(yǎng)低聚果糖導致雙歧桿菌數(shù)量大大增加，從而減少LPS 產(chǎn)生的炎癥標志物；Joossens 等[8]報道17 名志愿者攝入富含低聚果糖的菊粉，導致雙歧桿菌和青春雙歧桿菌物種的顯著增加。益生元的種類有很多，主要包括低聚糖類、多元醇、蛋白質(zhì)水解物以及天然植物提取物等。目前研究和應用較多的是功能性低聚糖類，如低聚木糖和低聚果糖。植物提取物作為天然食品的來源具有更好的發(fā)展優(yōu)勢和前景，符合人們對健康飲食潮流的追求。

人參是天然植物資源的一種，其藥用歷史已有4 000 余年[9]。根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》和《新資源食品管理方法》的規(guī)定，2012年8月29日批準人參（人工種植）為新資源食品，由此人參作為藥食兼用植物進入日常生活中[10]。紅參是人參蒸制干燥后的熟制品，富含人參皂苷、多糖[11]、多肽、微量元素和氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有補氣、補血，復脈固脫、安神定魂和止驚悸等功效，又因其具有提高免疫力，抗腫瘤、抗輻射以及抗衰老等生理功能而被廣泛應用于醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域等。目前對紅參多糖的研究不多，主要集中在提取、純化和鑒定以及藥理與臨床應用等方面，其作為益生元的益生功能方面的研究幾乎沒有[12]。僅本實驗室丁碩[13]曾研究紅參等9 種健脾胃天然植物對益生菌體外生長的影響。對紅參作為益生元研究的缺乏，限制了紅參的應用。有必要研究紅參對乳酸菌的體外增菌效果。

本試驗中以紅參為主要材料，以典型益生元低聚木糖和低聚果糖[14-15]為參照，研究紅參對典型益生菌鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和傳統(tǒng)發(fā)酵菌保加利亞乳桿菌ATCC 11842 兩株菌體外生長的影響，為紅參調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群失調(diào)的體內(nèi)試驗奠定基礎(chǔ)，也為發(fā)掘功能性食品與飼料奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）AS 1.2466T、德式乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）ATCC 11842，中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.2 原材料 紅參片，保定市普康大藥房提供；低聚果糖（FOS）和低聚木糖（XOS），保齡寶生物股份有限公司。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基 蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水定容1 L，121 ℃，15 min 滅菌。

2）菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基 菊芋→清洗稱重→加水（m料∶m水=1∶1）→加熱滅酶（100 ℃，5 min）→加水搗碎（補加適量 80 ℃水）→過濾（100 目濾布）→濾渣加水壓榨→加水定容100 mL→調(diào)配（糖度約10 Brix，pH 6.5～7.0）→加熱滅菌（121 ℃15 min）→冷卻，備用。

1.1.4 主要設備與儀器 FLC-3 超凈臺，哈爾濱市東聯(lián)公司；YXQG02 型電熱式蒸汽消毒器，山東新華醫(yī)療器械廠；SPX-150B-Z 型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；TGL16M 型離心機，長沙市易達科貿(mào)公司；GR-206SVQ 型LG 冰箱，泰州樂金電子冷機有限公司；TU-1810 紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株生長曲線的繪制 鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T/保加利亞乳桿菌ATCC 11842 經(jīng)MRS 液體培養(yǎng)基活化至109CFU/mL/108CFU/mL，以1%的接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基/菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基和液MRS 中，37 ℃/42 ℃培養(yǎng)，每隔2 h 取樣測定OD600值。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制兩株菌在不同培養(yǎng)基中的生長曲線。

1.2.2 紅參多糖含量的測定

1）紅參提取液制備 稱取紅參100 g，加水200 mL 浸泡過夜，置于95 ℃水浴3 h，過濾，取濾渣加水200 mL 繼續(xù)水浴，最后合并濾液濃縮至100 mL，按照藥液質(zhì)量分數(shù)100 g 紅參∶100 g 水定義為100%原藥液。

2）紅參酸水解物制備[16]模擬人體胃環(huán)境，將紅參提取液pH 值調(diào)為3.0，37 ℃培養(yǎng)箱恒溫4 h，制成紅參酸水解物。

3）紅參多糖含量測定 采用苯酚硫酸法[12]測定紅參提取液多糖含量。分別取葡萄糖標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，補水至2 mL，搖勻。各加入1 mL 的5%苯酚溶液，搖勻后迅速加入5.0 mL 濃硫酸，混勻，靜置10 min 后40 ℃水浴15 min，冷卻至室溫，測定OD490值。以OD490值為縱坐標，葡萄糖標準液濃度為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。吸取紅參提取液1 mL，稀釋到合適倍數(shù)，以1 mL 蒸餾水為空白對照，按照上述操作測定紅參提取液的多糖含量。

1.2.3 3 種益生元對兩株乳酸菌體外生長的影響

向基礎(chǔ)培養(yǎng)基/菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加質(zhì)量分數(shù)為0%，3.125%，6.25%，12.50%，25%和50%的紅參提取液及其酸水解物以及0%，0.4%，0.8%，1.2%，1.6%和2.0%的低聚果糖和低聚木糖。將活化好的鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T/保加利亞乳桿菌ATCC 11842 以1%接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基/菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基及其添加不同量益生元的基礎(chǔ)培養(yǎng)基/菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37 ℃/42℃恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長末期，取菌，測定其吸光度OD600和活菌數(shù)。根據(jù)OD600值和活菌數(shù)比較紅參提取液及其酸水解物和兩種低聚糖對鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和保加利亞乳桿菌ATCC 11842 體外生長的作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株生長曲線的測定

鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和保加利亞乳桿菌ATCC 11842 生長曲線測定結(jié)果見圖1、2。

由圖1可知，鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T在MRS 和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中均在14 h 達到對數(shù)生長末期，此時的OD600值分別為1.634 和0.357，相對應活菌數(shù)分別為1.45×109CFU/mL 和7.75×107CFU/mL。

圖1 鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T 在MRS和基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 The growth curve of Lactobacillus rhamnosus AS 1.2466T in MRS medium and basic culture medium

圖2 保加利亞乳桿菌ATCC 11842 在MRS和菊芋汁培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.2 The growth curve of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC 11842 in MRS medium and Jerusalem artichoke juice base medium

由圖2可見，保加利亞乳桿菌ATCC 11842在MRS 培養(yǎng)基中16 h 時進入對數(shù)生長末期，此時OD600值為1.272，對應活菌數(shù)為3.25×108CFU/mL。在菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中18 h 達到對數(shù)生長末期，此時OD600值為0.331，對應活菌數(shù)為1.48×107CFU/mL。

以上結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和保加利亞乳桿菌ATCC 11842 均可在相應基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長，并且生長趨勢沒有明顯變化。最終確定兩種基礎(chǔ)培養(yǎng)基的可應用性以及兩株菌的取菌時間分別為14 h 和16 h。

2.2 紅參提取液多糖濃度的測定

葡萄糖標準曲線見圖3。通過葡萄糖標準曲線來計算紅參提取液中的多糖濃度。紅參提取液多糖質(zhì)量濃度為（1.0605×105±0.0367）μg/mL。

圖3 葡萄糖標準曲線Fig.3 Standard curve of glucose

2.3 不同益生元對乳酸菌體外生長的影響

低聚木糖和低聚果糖對鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和保加利亞乳桿菌ATCC 11842 的增菌效果如圖4所示。

由圖4可知，對兩株菌增菌效果較優(yōu)的均為低聚木糖，其添加量為0.8%時鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T的OD600值最大為0.986，活菌數(shù)為1.03×108CFU/mL，相較于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中最大活菌數(shù)7.75×107CFU/mL 增加1 個數(shù)量級。低聚果糖的增菌效果雖弱于低聚木糖，但其OD600值和活菌數(shù)均比基礎(chǔ)培養(yǎng)基的高，其最適添加量為1.2%時OD600值最大值為0.659，活菌數(shù)為9.65×107CFU/mL。此結(jié)果和Zhao P L 等[17]的研究結(jié)果相似。

低聚木糖添加量為0.4%時保加利亞乳桿菌ATCC 11842 的最大OD600值為0.586，活菌數(shù)為2.13×108CFU/mL，比菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中最大活菌數(shù)1.48×107CFU/mL 增加1 個數(shù)量級。隨著低聚木糖濃度的增加，增菌效果呈明顯的下降趨勢，在其添加量為2.0%時出現(xiàn)抑制菌株生長的現(xiàn)象。低聚果糖的增菌效果不明顯，當添加量為1.2%時OD600值為0.444，活菌數(shù)相較于菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基并沒有數(shù)量級增加，和舒國偉等[18]的研究結(jié)果不一致，這是因為益生元對益生菌的促生長作用具有菌株差異性[19]。此外，低聚木糖和低聚果糖對菌株生長的影響均表現(xiàn)為低濃度促進，高濃度抑制現(xiàn)象[20]，這和文宇婷等[21]的研究結(jié)果相一致。

紅參作為藥食兼用植物在進入機體后，經(jīng)過pH 3.0 的胃液消化1～2 h[22]。將紅參提取液在人工胃環(huán)境中消化2 h 制成紅參酸水解物。紅參提取液及其酸水解物對鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和保加利亞乳桿菌ATCC 11842 的增菌效果如圖5所示。

由圖5可知，紅參提取液及其酸水解物對鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和保加利亞乳桿菌ATCC 11842 均有促生長作用。當紅參提取液添加量為12.50%時，鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T最大OD600值為1.172，此時活菌數(shù)為1.17×108CFU/mL，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基中最大活菌數(shù)7.75×107CFU/ mL 增加1個數(shù)量級；當紅參提取液添加量為6.25%時，保加利亞乳桿菌ATCC 11842 最大OD600值為0.627，此時活菌數(shù)為4.43×108CFU/mL，比菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基中最大活菌數(shù)1.48×107CFU/mL 增加1 個數(shù)量級。

當紅參酸水解物添加量為3.125%時，鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和保加利亞乳桿菌ATCC 11842均達到最大OD600值，分別為1.048 和0.678，此時最大活菌數(shù)分別為1.05×108CFU/mL和1.03×108CFU/mL，均比對應基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的活菌數(shù)增加1 個數(shù)量級。

此外，紅參提取液及其酸水解物的添加量并非越高越好。當紅參提取液添加量為25%時開始抑制保加利亞乳桿菌ATCC 11842 的生長，其對鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T的促生長作用也隨著紅參提取液濃度的增加而逐漸下降。兩株菌的OD600值和紅參酸水解物的添加量呈負相關(guān)，當紅參酸水解物添加量為12.50%時開始抑制保加利亞乳桿菌ATCC 11842 的生長，當其添加量為50%時抑制鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T的生長，這可能是因為紅參多糖經(jīng)酸水解后分解為小分子多糖，可以更好地被菌株吸收利用，然而多糖濃度過高誘導菌體因高滲透環(huán)境而脫水，抑制其生長，甚至死亡[11]，說明益生元的添加量并非越高越好。

圖4 低聚木糖和低聚果糖對鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和保加利亞乳桿菌ATCC 11842 體外生長的影響Fig.4 The effect of XOS and FOS on the growth of Lactobacillus rhamnose AS 1.2466T and Lactobacillus bulgaricus ATCC 11842 in vitro

圖5 紅參提取液和紅參酸水解物對鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和保加利亞乳桿菌ATCC 11842 體外生長的影響Fig.5 The effect of Red ginseng liquid medicine and its acid hydrolyzate on the growth of Lactobacillus rhamnose AS 1.2466T and Lactobacillus bulgaricus ATCC 11842 in vitro

3 討論

功能性低聚糖是傳統(tǒng)、公認、被研究最多的益生元，雖不被人體消化吸收但被腸道菌群利用，對宿主產(chǎn)生有益影響。本試驗通過體外培養(yǎng)的方法，得到紅參提取液對保加利亞乳桿菌ATCC 11842和鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T的增菌效果顯著優(yōu)于低聚木糖和低聚果糖，表明紅參作為一種新型天然植物益生元，具有較好的研究價值和發(fā)展前景。

乳酸菌在乳制品發(fā)酵和儲藏過程中的活菌數(shù)決定著該乳制品益生功效的高、低[23]。乳酸菌活菌數(shù)的增加對解決乳制品發(fā)酵和儲藏期間活菌數(shù)低的問題具有重要意義。保加利亞乳桿菌是發(fā)酵乳制品中最常用的乳酸菌，也是最具商業(yè)價值的乳酸菌之一，被廣泛應用于酸奶的發(fā)酵[24]。鼠李糖乳桿菌是典型的益生菌，可以耐受胃酸和膽鹽而長時間地定植在人體腸道中[25]，具有調(diào)節(jié)宿主腸道微生態(tài)和免疫力的功能，其在發(fā)酵期間只產(chǎn)生1種L-乳酸，不會產(chǎn)生對產(chǎn)品口感和安全性有影響的其它酸類物質(zhì)而被廣泛應用于保健品和功能性乳品中[26]。本試驗用這兩株菌為試驗菌株，研究發(fā)現(xiàn)，在菊芋汁基礎(chǔ)培養(yǎng)基/基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加紅參提取液或紅參酸水解物，均可使保加利亞乳桿菌ATCC 11842/鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T的活菌數(shù)增加1 個數(shù)量級，紅參提取液對保加利亞乳桿菌的增菌效果是低聚木糖的兩倍。實際應用本研究結(jié)果，有助于乳制品企業(yè)合理設計添加紅參的發(fā)酵乳制品，這對于生產(chǎn)營養(yǎng)保健功能的發(fā)酵乳制品具有重要意義。劉彥亮等[27]研究表明，椏胡蘆和蘆根可分別促進雙歧桿菌活菌數(shù)達到3.2×108CFU/mL 和1.7×108CFU/mL。本研究顯示紅參可以促進保加利亞乳桿菌活菌數(shù)達到4.43×108CFU/mL，此結(jié)果與文獻[6]至[8]報道的低聚果糖促進雙歧桿菌物種增加的結(jié)果相似，紅參也具有較好的促保加利亞乳桿菌和鼠李糖乳桿菌生長作用。與丁碩[13]的研究結(jié)果相似，紅參不僅對雙歧桿菌和鼠李糖乳桿菌具有促生長作用，對保加利亞乳桿菌ATCC 11842 也有促生長作用。李艷麗等[28]研究表明，低聚木糖可使枯草芽孢桿菌增殖183%。陳虹等[29]研究表明新瓊寡糖可使保加利亞乳桿菌增殖77.6%。本研究結(jié)果：紅參對保加利亞乳桿菌的增殖作用高達299%，紅參的增殖作用遠遠高于低聚木糖和新瓊寡糖，表明紅參具有較好的益生元特性。

4 結(jié)論

低聚木糖增菌效果優(yōu)于低聚果糖，添加量分別為0.8%和0.4%時鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和保加利亞乳桿菌ATCC 11842 增菌效果最佳。紅參提取液及其酸水解物對鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和保加利亞乳桿菌ATCC 11842 均有更好的促生長作用。當紅參提取液添加量分別為12.50%和6.25%時，鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T和保加利亞乳桿菌ATCC 11842 增菌效果最佳。不同添加物對鼠李糖乳桿菌AS 1.2466T的增菌效果為紅參提取液＞紅參酸水解物＞低聚木糖＞低聚果糖。對保加利亞乳桿菌ATCC 11842 的增菌效果為紅參提取液＞低聚木糖＞紅參酸水解物＞低聚果糖。紅參顯示出優(yōu)良的益生元特性。