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      福建省樟樹潰瘍病病原菌的分離與鑒定

      2020-05-24 12:31:34張曉陽王美鑫韓森匯陳全助
      關(guān)鍵詞:潰瘍病分生孢子枝干

      張曉陽,吳 松,王美鑫,韓森匯,宋 漳,陳全助

      (1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院,福建 福州 350002;2.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院,福建 福州 350002)

      樟樹[Cinnamomumcamphora(L.) Presl],又名香樟、芳樟,屬樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠喬木,是國務(wù)院1999年8月4日批準(zhǔn)的國家Ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)野生植物之一[1]。樟樹材質(zhì)致密美觀,含有特殊香氣,耐濕,抗腐防蟲,是造船、家具等行業(yè)的上等用材。樟樹植株全身皆可提取樟腦和芳香油,廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥,是重要的特用經(jīng)濟(jì)林[2]。隨著人們對樟樹資源潛在價(jià)值認(rèn)識的深入及開發(fā)利用技術(shù)的提高,全國各樟樹適生區(qū)開始大面積種植樟樹[3]。樟樹自然分布于中國南方各省、越南以及日本等地[4-6],亞洲東部、大洋洲和太平洋諸島也都有分布。2015年以來,福建省全省林業(yè)有害生物普查發(fā)現(xiàn),福州、三明、龍巖和南平等地均有樟樹潰瘍病的分布,其中僅南平市順昌縣受害面積便高達(dá)20 hm2,為樟樹種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展敲響了警鐘,摸清該病害的病原菌也成了迫在眉睫的任務(wù)。

      樟樹潰瘍病1994年首次在湖南發(fā)現(xiàn),郭立中等[7]初次鑒定病原為囊孢殼菌(Physalosporasp.),有性態(tài)為大莖點(diǎn)霉(Macrophomasp.);隨后鄧先瓊等[8]調(diào)整鑒定病原有性態(tài)為葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea),無性態(tài)為七葉樹殼梭孢(Fusicoccumaesculi)。在2019年翟立峰等[9]對重慶樟樹潰瘍病進(jìn)行了分離和系統(tǒng)鑒定,前期的研究范圍主要集中在湖南[7-8]、江蘇[10]和上海[11]等地,目前關(guān)于福建省樟樹潰瘍病的研究鮮見報(bào)道。鑒于此,本研究通過采集福建省內(nèi)樟樹潰瘍病樣本進(jìn)行病原菌純化,根據(jù)病原菌的形態(tài)學(xué)特征、致病性以及對核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer of ribosome gene,ITS)、翻譯延伸因子(translation elongation factor,EF-1α)、RNA聚合酶Ⅱ大亞基(RNA polymerase Ⅱ large subunit,RPB2)和β-微管蛋白(β-tubulin,BT)基因序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序,對病原菌進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定,從而填補(bǔ)福建省樟樹潰瘍病研究這一空缺。

      1 材料與方法

      1.1 供試菌株

      樣本采集自福建省福州市倉山區(qū)、三明市明溪縣、南平市建陽區(qū)和順昌縣,現(xiàn)由福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所保存。

      1.2 病原菌分離與純化

      采用常規(guī)病組織分離法[12]。取病健交界處表皮,剪成5 mm×5 mm的組織塊,用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精浸泡30 s,再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的升汞浸泡1 min后,用無菌水漂洗3遍,置于濾紙上吸干水分,將組織塊呈梅花狀置于先前倒好的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)平板上。28 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng),待組織塊周圍長出菌絲后,挑取菌絲移至新的PDA平板中繼續(xù)培養(yǎng),根據(jù)菌落的顏色以及形態(tài)特征編號。

      1.3 致病性測定

      根據(jù)柯赫氏法則,采用活體針刺和無傷接種法進(jìn)行致病性測定。將菌餅接種在健康且長勢基本一致的2年生樟樹幼苗枝干上,對照組接種空白PDA,每個(gè)處理重復(fù)3次,用濕潤的脫脂棉包扎,最外面使用醫(yī)用膠帶固定,將接種的幼苗置于溫室30 ℃保濕培養(yǎng),逐日測量病斑的長度與寬度,并利用橢圓面積公式計(jì)算病斑擴(kuò)展面積。取接種發(fā)病后的部位進(jìn)行組織分離、鏡檢觀察和ITS序列比較,確定病原菌,將具有致病性的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

      將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上,28 ℃黑暗培養(yǎng),觀察記錄菌落形態(tài)[13],并在接種的枝干上每日觀察枝干表面子實(shí)體形成的情況,子實(shí)體形成后采用冷凍切片和壓片的方法在顯微鏡下觀察菌株的子實(shí)體和孢子形態(tài),顯微鏡拍照并測量孢子大小。

      1.5 病原菌分子鑒定

      將菌株接種在PDA平板上,28 ℃黑暗培養(yǎng)3 d后刮取新鮮的菌絲,采用SP Fungal DNA Kit試劑盒,提取病原菌脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA),分別對ITS、EF-1α、RPB2和BT基因序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增[14-15]。反應(yīng)參數(shù)為:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,52~55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min;35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存10 min。將擴(kuò)增好的DNA條帶,使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒進(jìn)行DNA回收,之后將DNA片段連接到載體pMD18-T上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)過陽性驗(yàn)證后,將菌液送至北京擎科生物科技公司測序。

      1.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

      將得到的序列在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)里初步比對,然后整理自己的序列和下載的對比序列,按照ITS、EF-1α、RPB2、BT的順序建立一個(gè)文本,利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行對齊分析,將輸出的文件使用Sequence Matrix軟件進(jìn)行4個(gè)基因的串聯(lián)拼接,用數(shù)據(jù)分析模型和鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,自展支持值(bootstrap)為1 000。

      1.7 數(shù)據(jù)處理

      采用SPSS 21.0軟件對病斑擴(kuò)展數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以Duncan′s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。測量孢子大小得出的數(shù)據(jù)采用Excel 2007軟件進(jìn)行分析。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 樟樹潰瘍病病害癥狀

      樟樹枝干潰瘍病從3月份開始出現(xiàn),該病害最初在枝干、枝丫出現(xiàn)近圓形黑褐色病斑,隨著病斑的擴(kuò)展枝干開始凹陷,在枝干表皮開始有黑色子實(shí)體產(chǎn)生,如圖1(a)所示,隨著病斑擴(kuò)展形成梭形病斑,并且顏色加深;后期發(fā)病處樹皮開裂甚至腫大形成瘤狀物,如圖1(b)所示;病斑以上的枝條和葉片逐漸壞死,如圖1(c)所示。該病害在林間擴(kuò)展迅速,短時(shí)間內(nèi)可形成大面積的枝干枯死,危害巨大。

      (a)枝干上的子實(shí)體Fruit bodies on the branch (b)枝干開裂Cracked branches (c)頂端枯萎Apical blight

      圖1 樟樹潰瘍病癥狀
      Figure 1 Symptoms of camphor tree canker disease

      2.2 病原菌的致病性測定

      采用活體接種的方式將不同地區(qū)分離到的75份菌株在盆栽的樟樹幼苗上進(jìn)行致病性測定。結(jié)果顯示,在接種JY-1、JY-2、JY-3、JY-4、JY-5、JY-6、FZ-1、MX-5和SC-1菌株的樟樹枝干上出現(xiàn)潰瘍癥狀,接種2 d后開始有淺褐色近圓形的病斑出現(xiàn),其中JY-5、MX-5、SC-1菌株有少量菌絲產(chǎn)生。隨著病斑的擴(kuò)展,形成近橢圓或梭形的褐黑色病斑;7 d后枝干病斑內(nèi)周開始產(chǎn)生黑色子實(shí)體,并且病斑開始輕微凹陷;接種病原菌21 d的病斑形態(tài)如圖2所示,后期病斑逐漸環(huán)繞,病斑上部的枝干開始出現(xiàn)枯死。

      (a)CK(b)JY-1(c)JY-2 (d)JY-3 (e)JY-4

      (f)JY-5(g)JY-6(h)FZ-1(i)MX-5(j)SC-1

      圖2 接種病原菌21 d的病斑形態(tài)
      Figure 2 Speckle morphology of trees after 21 days of inoculation

      對發(fā)病的枝條進(jìn)行再分離,所得病原菌與原接種病菌形態(tài)一致,并且ITS序列相同。對不同致病菌株接種樟樹幼苗后21 d的病斑面積進(jìn)行差異性顯著分析,結(jié)果如圖3所示:不同菌株之間致病性差異顯著,其中JY-5菌株致病性最強(qiáng),病斑面積達(dá)340.17 mm2,JY-2菌株的致病性最弱,病斑面積為51.94 mm2。

      注:不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。Note: the different lowercase letters indicate the difference at level 0.05.

      圖3 不同致病菌株對樟樹幼苗的致病性測定
      Figure 3 Pathogenicity of different pathogenic strains on camphor seedlings

      2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)特性

      從不同地區(qū)共采集到樟樹潰瘍病樣品75份,經(jīng)過組織分離,致病性測定,最后得到43株具有葡萄座腔菌屬真菌特征的菌株。根據(jù)在PDA上的菌落形態(tài)和孢子特征分為4個(gè)類型,分別為Ⅰ型(JY-5、JY-8、JY-13、JY-34、JY-35、MX-5、MX-7、MX-8、MX-11、MX-21、SC-1、SC-4、SC-7),Ⅱ型(JY-1、JY-2、JY-4、JY-6、JY-9、JY-22、JY-23、JY-40、MX-2、MX-3、MX-9、MX-23、MX-24、MX-25、MX-37、SC-9、SC-10、FZ-6),Ⅲ型(JY-3、JY-15、JY-17、MX-1、MX-15、FZ-4),Ⅳ型(FZ-1、FZ-2、FZ-3、FZ-12、FZ-13、FZ-33)。

      代表菌株JY-5的菌落特征和分生孢子形態(tài)與小新殼梭孢(N.parvum)相似,小新殼梭孢形態(tài)學(xué)特征如圖4所示。從圖4可以看出,在PDA平板上,菌落為白色,氣生菌絲較為密集,2 d后菌落氣生菌絲變成灰白色,菌落背部開始出現(xiàn)橄欖綠色,后期菌落上部為一些白色氣生菌絲,下部的菌絲變成黑色,菌落背部為深灰色或者黑色。分生孢子器著生在樟樹枝干表面,黑色、近球形、單腔。分生孢子器壁褐色,由致密、厚壁的角質(zhì)化組織構(gòu)成。分生孢子梗無色透明,著生在分生孢子器的內(nèi)壁上,短棒狀、尖端略尖,產(chǎn)生分生孢子。分生孢子單孢,近橢圓形至紡錘形,薄壁、無隔、無色透明,且內(nèi)有油球,大小為(11.90~18.90) μm×(5.34~7.29) μm。

      (a)前期和后期的菌落正面The front of the colony in the early and later stages(b)分生孢子器Pycnidium(c)子囊Ascus

      (d)分生孢子Conidia(e)萌發(fā)的分生孢子Germinated conidia(f)萌發(fā)的分生孢子Germinated conidia

      圖4 小新殼梭孢形態(tài)學(xué)特征
      Figure 4 Morphological characteristics ofN.parvum

      根據(jù)代表菌株JY-3的菌落特征和分生孢子形態(tài)初步判定為假可可毛色二孢(L.pseudotheobromae),其形態(tài)學(xué)特征如圖5所示。從圖5可以看出,在PDA平板上,菌落氣生菌絲較為稀疏,顏色呈白色,菌落背部也呈白色。菌落后期菌絲變密,顏色呈灰黑色,菌落背部也呈灰黑色;分生孢子器,單腔,大小不一致,在分生孢子器內(nèi)組織形成分生孢子梗,從而形成分生孢子。該菌株會形成2種類型分生孢子,初期分生孢子無色透明,棒狀或者近橢圓形,無隔膜,內(nèi)含油球,大小為(20.65~29.10) μm×(11.06~17.51) μm,壁厚達(dá)(1.04±0.02) μm;成熟孢子顏色呈褐色,出現(xiàn)橫膈膜,并且有縱紋產(chǎn)生,大小為(20.83~30.96) μm×(12.46~16.19) μm。

      (a)前期菌落形態(tài)(正面和反面)Early colony morphology(front and back)(b)后期菌落形態(tài)(正面和反面)Late colony morphology(front and back)(c)分生孢子器和分生孢子梗Pycnidium and conidiophore

      (d)分生孢子Conidia(e)萌發(fā)的孢子Germinated conidia(f)成熟的分生孢子Mature conidia

      圖5 假可可毛色二孢形態(tài)學(xué)特征
      Figure 5 Morphological characteristics ofL.pseudotheobromae

      根據(jù)代表菌株JY-6的菌落特征和分生孢子形態(tài)初步判定為可可毛色二孢(L.theobromae),其形態(tài)學(xué)特征如圖6所示。從圖6可以看出,菌落正面氣生菌絲較為密集,顏色呈白色,菌落背部也呈白色。菌落后期菌絲顏色呈灰黑色,菌落背部呈灰黑色。分生孢子器,單腔,大小不一致,在分生孢子器內(nèi)組織形成分生孢子梗,從而形成分生孢子。該菌株會形成2種類型分生孢子,初期分生孢子無色透明,近橢圓形,無隔膜,內(nèi)含油球,大小為(17.64~29.72) μm×(11.28~18.38) μm,壁厚達(dá)(0.94±0.01) μm;成熟孢子顏色呈褐色,出現(xiàn)橫膈膜,顏色較深并且有縱紋產(chǎn)生,大小為(19.92~27.83) μm×(12.11~15.14) μm。

      (a)前期菌落形態(tài)(正面和反面)Early colony morphology(front and back)(b)后期菌落形態(tài)(正面和反面)Late colony morphology(front and back)(c)分生孢子器Pycnidium

      (d)分生孢子梗Conidiophore(e)早期的分生孢子Early conidia(f)成熟的分生孢子Mature conidia

      圖6 可可毛色二孢形態(tài)學(xué)特征
      Figure 6 Morphological characteristics ofL.theobromae

      根據(jù)代表菌株FZ-1的菌落特征和分生孢子形態(tài)初步判定為L.iranensis,其形態(tài)學(xué)特征如圖7所示。從圖7可以看出,菌落正面氣生菌絲較為密集,顏色呈白色,菌落背部也呈白色。菌落后期菌絲顏色呈灰黑色,菌落背部呈灰黑色。分生孢子器,單腔,大小不一致,直徑可達(dá)228.57 μm。在分生孢子器內(nèi)組織形成分生孢子梗和側(cè)絲,側(cè)絲較為明顯,分生孢子梗上產(chǎn)生分生孢子。該菌株會形成2種類型分生孢子,初期分生孢子無色透明,近橢圓形或者棒狀,無隔膜,內(nèi)含油球,大小為(21.62~31.23) μm×(11.46~16.19) μm,壁厚達(dá)(1.32±0.02)μm;成熟孢子顏色呈褐色,出現(xiàn)橫膈膜,顏色較深并且有縱紋產(chǎn)生,大小為(19.30~26.25) μm×(11.65~14.91) μm。

      (a)前期菌落形態(tài)(正面和反面)Early colony morphology(front and back)(b)后期菌落形態(tài)(正面和反面)Late colony morphology(front and back)(c)分生孢子器Pycnidium

      (d)分生孢子梗Conidiophore(e)早期的分生孢子Early conidia(f)成熟的分生孢子Mature conidia

      圖7L.iranensis形態(tài)學(xué)特征
      Figure 7 Morphological characteristics ofL.iranensis

      2.4 病原菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

      經(jīng)過對9個(gè)代表菌株的ITS、EF-1α、RPB2和BT序列進(jìn)行擴(kuò)增和測序,對得到的序列進(jìn)行串聯(lián)分析,最后構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果如圖8、圖9所示,SC-1、JY-5、MX-5這3個(gè)代表菌株都與N.parvum聚在同一組群上。JY-3菌株聚在L.pseudotheobromae上,與菌株CBS 116459相似性達(dá)97%,F(xiàn)Z-1菌株聚在L.iranensis上,與菌株CBS 124710相似性達(dá)99%,其他4個(gè)菌株都聚在L.theobromae這一組群上。

      注:進(jìn)化樹分支上的數(shù)值表示置信度。Note: the value on the branch of the phylogenetic tree represents the confidence.

      圖8 新殼梭孢屬代表菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹
      Figure 8 Phylogenetic tree of the representing strains of the genusNeofusicoccum

      注:進(jìn)化樹分支上的數(shù)值表示置信度。Note: the value on the branch of the phylogenetic tree represents the confidence.

      圖9 毛色二孢屬代表菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹
      Figure 9 The phylogenetic tree of the representing strains of the genusLasiodiplodia

      3 討論與結(jié)論

      毛色二孢屬(Lasiodiplodia)和新殼梭孢屬(Neofusicoccum)[16-17]都屬于葡萄座腔菌科(Botryosphaericeae)無性階段的菌物,有性態(tài)屬于葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)。它們的寄主廣泛,能夠侵染多數(shù)的果樹和經(jīng)濟(jì)樹種。對于潰瘍病已報(bào)道的有桉樹潰瘍病[18]、核桃潰瘍病[19]、胡桃木莖潰瘍病[20]和澳大利亞松樹潰瘍病[21]等。本研究在國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)了小新殼梭孢的有性態(tài)孢子,其形態(tài)為具有棒狀子囊,子囊內(nèi)含有8個(gè)不規(guī)則排列的子囊孢子,子囊孢子和分生孢子形態(tài)相似。對于毛色二孢菌暫未發(fā)現(xiàn)有性態(tài),故在本研究中,對于病原菌的命名統(tǒng)一使用無性態(tài)來命名。

      對福建省內(nèi)樟樹枝干潰瘍病樣本分離,經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后結(jié)合ITS、EF-1α、RPB2和BT串聯(lián)基因序列進(jìn)行分子鑒定,最終確定4種類型菌株,分別為小新殼梭孢(代表菌株JY-5、MX-5、SC-1),假可可毛色二孢(代表菌株JY-3),可可毛色二孢(代表菌株JY-2、JY-2、JY-4、JY-6),L.iranensis(代表菌株FZ-1)。樟樹潰瘍病首次在湖南發(fā)現(xiàn)[7]后經(jīng)鄧先瓊等[8]調(diào)整鑒定為B.dothidea,以及在2019年翟立峰等[9]的研究中將可可毛色二孢(有性態(tài):B.dothidea)和小新殼梭孢(有性態(tài):B.parva)作為病原菌進(jìn)行了報(bào)道,以上報(bào)道與本研究結(jié)果一致;與趙桂華[10]、王明生等[11]的研究結(jié)果有所偏差,其原因可能是地理位置的差異,使得植物和真菌均呈現(xiàn)出不同于其他地區(qū)的生長特性,且毛色二孢屬和新殼梭孢屬的菌株更易受溫濕度的影響。此外,本研究首次發(fā)現(xiàn)樟樹潰瘍病病原菌也包含假可可毛色二孢和L.iranensis這2種類型菌株。

      通過對致病性的研究表明,各種菌株之間的致病性差異明顯,其中小新殼梭孢最強(qiáng),L.iranensis最弱,但是所有致病菌株在無傷接種的情況下并不發(fā)病,這也為防治樟樹潰瘍病提供了一定的思路,在野外為樟樹修剪枝條時(shí),除了要在合適的時(shí)期進(jìn)行,修剪完后可以噴灑化學(xué)試劑,起到保護(hù)作用,避免因?yàn)樾拗χ圃斓膫趯?dǎo)致潰瘍病爆發(fā)。

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