氯霉素對(duì)鐵還原菌/針鐵礦異化還原的影響機(jī)制

李曉玲 史 柯 林欣雨 董華平

(紹興文理學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，浙江 紹興 312000)

抗生素具有很強(qiáng)的殺菌和抑菌作用，主要用于預(yù)防和治療人和動(dòng)物經(jīng)微生物感染引起的疾病，以及用作牲畜生長(zhǎng)的食物添加劑[1].由于抗生素在生物體內(nèi)不易代謝，大部分母體化合物隨著人和動(dòng)物的糞便排到環(huán)境中[2-3].通過(guò)土壤吸附、雨水沖刷和地表水滲漏等自然過(guò)程，使土壤、地下水和沉積物等厭氧環(huán)境中抗生素的含量不斷累積和暴露，導(dǎo)致抗性基因的大量擴(kuò)增和傳播，嚴(yán)重威脅人類健康和生態(tài)平衡[4].目前，環(huán)境中抗生素的降解去除主要采用芬頓[5]、光芬頓[6]、UV/H2O2[7]和零價(jià)鐵氧化還原[8]等方法，通過(guò)產(chǎn)生HO·和SO4·等活性組分將抗生素分解成小分子物質(zhì).但是，對(duì)于抗生素在土壤、地下水和沉積物等厭氧環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化，以及抗生素對(duì)微生物的抑菌性能的演變過(guò)程方面，目前研究甚少.

地下水、土壤、沉積物等厭氧環(huán)境中，存在大量豐富的含鐵礦物.這些礦物作為胞外電子受體，接受來(lái)自鐵還原菌的胞外電子，供鐵還原菌呼吸生長(zhǎng)，同時(shí)礦物表面Fe(III)被異化還原成Fe(II)[9-10].這些Fe(II)離子能夠吸附在礦物表面產(chǎn)生礦物結(jié)合Fe(II)，也能夠與其他元素相互作用產(chǎn)生新的次生礦物，如磁鐵礦、菱鐵礦等[11].通過(guò)礦物結(jié)合Fe(II)和新形成的次生礦物的還原作用，能夠降解環(huán)境中的硝基苯類化合物、氯代烷烴等有機(jī)污染物[12-13]，以及轉(zhuǎn)化環(huán)境中的Cr(VI)、U(VI)和Se(IV)/(VI)等重金屬離子[11].因此，異化鐵還原過(guò)程參與了地球上含鐵礦物及其他重金屬的遷移轉(zhuǎn)化，影響了碳、氮、硫、氧等元素的地球化學(xué)循環(huán).

研究表明，厭氧環(huán)境中共存的腐殖質(zhì)[14-15]、金屬離子[16]以及小分子有機(jī)酸[17]等組分，通過(guò)電子傳遞、配合等作用，影響鐵還原菌/鐵礦物的異化還原過(guò)程.然而，抗生素是否對(duì)鐵還原菌/含鐵礦物異化還原過(guò)程產(chǎn)生影響，異化鐵還原是否同時(shí)參與了抗生素的降解過(guò)程，亟待我們研究闡明.

為了更好地認(rèn)識(shí)抗生素在異化鐵還原體系等厭氧環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化，以及抗生素對(duì)異化鐵還原體系的影響，本文以環(huán)境中廣泛存在的針鐵礦(Goethite)為模式鐵礦物，脫色希瓦氏菌S12為模式鐵還原菌，氯霉素(CAP)作為模式抗生素，主要考察氯霉素對(duì)S12異化還原針鐵礦的影響，以及異化鐵還原對(duì)氯霉素抑菌作用的影響，采用XRD、SEM-EDS分析氯霉素存在下S12/針鐵礦異化還原產(chǎn)生次生礦物的類型，研究S12/針鐵礦體系還原降解氯霉素的主要活性組分，從而闡明氯霉素對(duì)S12/針鐵礦異化還原的作用機(jī)制.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

所用試劑均為分析純，氯霉素和針鐵礦購(gòu)自Sigma，鐵還原菌為脫色希瓦氏菌(ShewanelladecolorationisS12)，購(gòu)自海洋微生物菌種保藏管理中心.氯化鈉購(gòu)自浙江中星化工試劑有限公司；蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；十二水合磷酸氫二鈉、硫酸銨、無(wú)水硫酸鎂、N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、磷酸二氫鉀、DL-乳酸鈉溶液購(gòu)自Aladdin，所用水均為去離子水.

LB培養(yǎng)基和厭氧培養(yǎng)基配制方法如下：

LB培養(yǎng)基：稱量蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，氯化鈉1 g至100 mL去離子水中，攪拌至全部溶解，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，平均分裝為4份并密封， 高溫高壓滅菌(121 ℃， 20 min)，冷卻至室溫，待用.

厭氧培養(yǎng)基：分別稱量十二水合磷酸氫二鈉2 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸銨1 g，無(wú)水硫酸鎂0.2 g，HEPES 2.38 g至950 mL超純水中，攪拌使全部溶解，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0，定容至1000 mL.高溫高壓滅菌(121 ℃，20 min)，冷卻至室溫，待用.

1.2 微生物培養(yǎng)

在無(wú)菌操作臺(tái)上將S12接種至無(wú)菌LB培養(yǎng)基中， 置控溫振蕩器中(150 rpm， 30 ℃)培養(yǎng)12 h使生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期.將此生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的S12接種至無(wú)菌LB培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)12 h后，冷凍離心(6000 rpm，10 min，4 ℃)后棄去上清液，用厭氧培養(yǎng)基洗滌兩次，以此厭氧培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)λ=600 nm處調(diào)整其光吸收值(OD)為1.5，備用.

1.3 反應(yīng)條件

以針鐵礦+氯霉素作為對(duì)照體系，設(shè)計(jì)了以下三種反應(yīng)體系：S12+氯霉素、S12/針鐵礦、S12/針鐵礦+氯霉素.反應(yīng)總體積為100 mL，包含1 mL微量元素、10 mL乳酸鈉(0.2 mol/L)、1 mL維生素溶液、5 mL S12混懸液(OD=1.5，對(duì)照體系不加)、針鐵礦為0.2 g (S12/氯霉素體系不加)、 5 mL不同濃度的氯霉素溶液(2 ppm、 5 ppm、10 ppm、20 ppm，S12+針鐵礦體系不加)以及厭氧培養(yǎng)基.具體操作如下：在一系列250 mL玻璃瓶中分別加入針鐵礦、微量元素、乳酸鈉(0.2 mol/L)以及厭氧培養(yǎng)基，密封，高溫高壓滅菌(121 ℃，20 min)，冷卻至室溫，使用高純氮?dú)獬?0 min，此過(guò)程中分別加入維生素溶液、S12混懸液(OD=1.5)及不同濃度的氯霉素溶液，密封后放置于控溫振蕩器中(200 rpm，25 ℃)反應(yīng)，并定期取樣進(jìn)行測(cè)定.

1.4 分析方法

S12生物量的檢測(cè)按以下方法進(jìn)行：將0.1 mL反應(yīng)樣品取出后逐級(jí)稀釋，將稀釋后的樣品涂布在LB平板上，24 h后計(jì)數(shù)平板上的菌落個(gè)數(shù).鄰菲羅啉分光光度法測(cè)定反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的游離Fe(II)和總Fe(II)，其中總Fe(II)測(cè)定方法如下[18]：定期取反應(yīng)混懸液于10 mL離心管中，與1M無(wú)氧鹽酸1∶1(V/V)避光浸泡12 h. 隨后在一系列10 mL比色管中依次加入5 mL醋酸鹽緩沖液(pH 5.0)、1 mL上述反應(yīng)浸泡樣、1 mL 0.5%鄰菲羅啉，用去離子水定容至10 mL.靜置15 min后，用紫外分光光度計(jì)(λ=510 nm)測(cè)定吸光度.游離Fe(II)測(cè)定中取樣用微孔濾膜(孔徑為0.22 μm)過(guò)濾，其濾液與1 M無(wú)氧鹽酸1∶1(V/V)避光浸泡12 h，其他方法與總Fe(II)測(cè)定相同. 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算游離Fe(II)和總Fe(II)濃度，兩者相減即為礦物結(jié)合Fe(II)的濃度.氯霉素的濃度用高效液相色譜儀(HPLC)進(jìn)行分析測(cè)定，所用HPLC的具體參數(shù)如下：日本島津LC-20AT HPLC系統(tǒng)，使用安捷倫Eclipse Plus C18分析柱(4.6×150 mm，5 μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，流動(dòng)相為乙腈∶水=35∶65(V/V)，流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃.本實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定，CAP的出峰時(shí)間為3.2 min.固體樣品的表面晶型通過(guò)X-射線衍射儀測(cè)定，其測(cè)定條件為Cu靶，測(cè)試電壓為40 kV，測(cè)試電流為40 mA，掃描角度范圍為10～70°(2θ)，掃描步長(zhǎng)為0.026°，掃描速度為100 s/step.固體形貌及元素含量采用掃描電鏡(SEM, JEM-1011)-能量色散X射線光譜(EDS)測(cè)得.

2 結(jié)果與討論

2.1 氯霉素對(duì)S12/針鐵礦異化還原產(chǎn)生Fe(II)的影響

S12異化還原針鐵礦產(chǎn)生Fe(II)的變化曲線如圖1所示，由于我們沒(méi)有檢測(cè)到溶液中的游離Fe(II)，測(cè)得的Fe(II)可以確定為礦物結(jié)合Fe(II). 針鐵礦+氯霉素反應(yīng)體系中， 幾乎沒(méi)有Fe(II)的生成， 說(shuō)明氯霉素本身對(duì)針鐵礦沒(méi)有還原作用.S12/針鐵礦體系中，F(xiàn)e(II)的產(chǎn)生量隨著反應(yīng)進(jìn)行迅速增加， 反應(yīng)至第10天時(shí)，F(xiàn)e(II)的生成量達(dá)到4.5 mmol/L，說(shuō)明該S12對(duì)針鐵礦具有很強(qiáng)的還原能力.S12/針鐵礦+氯霉素體系中， Fe(II)的產(chǎn)生量大幅降低， 并隨著氯霉素的加入濃度從2 ppm逐漸增加至20 ppm，F(xiàn)e(II)的產(chǎn)生量從0.93 mmol/L明顯下降至0.25 mmol/L，說(shuō)明氯霉素能夠顯著抑制S12對(duì)針鐵礦的異化還原，其抑制作用隨氯霉素濃度的增加而明顯增強(qiáng).

(a)2 ppm CAP; (b)5 ppm CAP; (c)10 ppm CAP; (d)20 ppm CAP

圖1各反應(yīng)體系產(chǎn)生的Fe(II)濃度變化圖

為了弄清楚氯霉素是如何抑制異化鐵還原，我們對(duì)各反應(yīng)體系的S12生物量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示.在反應(yīng)初期，各反應(yīng)體系的生物量都出現(xiàn)了下降，這主要是由于S12作為一種兼性厭氧菌，在有氧環(huán)境中的生長(zhǎng)代謝比無(wú)氧環(huán)境要旺盛許多，從有氧環(huán)境轉(zhuǎn)移到無(wú)氧環(huán)境，微生物有一個(gè)逐漸適應(yīng)過(guò)程.S12/針鐵礦體系中，S12的生物量在反應(yīng)第5天后迅速回升，隨后穩(wěn)定在2.2×107CFU/mL左右，說(shuō)明S12能夠利用針鐵礦作為末端電子受體進(jìn)行呼吸生長(zhǎng).而在S12+氯霉素體系中，生物量出現(xiàn)了2～5個(gè)數(shù)量級(jí)的下降，隨著氯霉素的濃度從2 ppm增加至20 ppm，生物量從1.5×105CFU/mL下降至2.0×102CFU/mL，說(shuō)明氯霉素對(duì)S12具有很強(qiáng)的抑菌作用. S12/針鐵礦+氯霉素體系中， S12的生物量也出現(xiàn)了下降， 但下降幅度明顯緩和許多(大約1個(gè)數(shù)量級(jí)之內(nèi)). 當(dāng)氯霉素的初始加入濃度為20 ppm時(shí)，生物量下降至3.1×106CFU/mL左右，約為S12/針鐵礦體系中生物量的1/8左右.因此，可以確定氯霉素通過(guò)抑菌作用使S12的生物量明顯減少，從而抑制了S12/針鐵礦的異化還原.然而，仔細(xì)比較S12/針鐵礦和S12/針鐵礦+氯霉素(20 ppm)體系的生物量和Fe(II)產(chǎn)生量，我們發(fā)現(xiàn)生物量的下降幅度(8倍左右)遠(yuǎn)比Fe(II)的下降幅度(20倍)要小許多，說(shuō)明S12/針鐵礦+氯霉素(20 ppm)體系中有部分產(chǎn)生的Fe(II)被消耗利用了.對(duì)比S12+氯霉素(20 ppm)和S12/針鐵礦+氯霉素(20 ppm)體系的生物量變化，后者的生物量比前者高出4個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明異化鐵還原過(guò)程的存在顯著減輕了氯霉素對(duì)S12的抑菌作用.

2.2 S12/針鐵礦異化還原過(guò)程中氯霉素的去除

我們考察了S12+氯霉素、S12/針鐵礦+氯霉素等體系中氯霉素的去除情況，結(jié)果如圖3所示.針鐵礦+氯霉素作為對(duì)照，在該體系中氯霉素幾乎沒(méi)有去除，說(shuō)明針鐵礦對(duì)氯霉素沒(méi)有吸附作用.在S12+氯霉素體系中，不同初始濃度的氯霉素均出現(xiàn)了一定的下降，反應(yīng)10天后，初始濃度為2 ppm、5 ppm、10 ppm、20 ppm的氯霉素去除率分別為54.1%、40.9%、38%和19.5%，可見(jiàn)隨著初始濃度的提高氯霉素的去除率明顯下降.該結(jié)果說(shuō)明當(dāng)氯霉素初始濃度較低時(shí)，S12可以利用一部分氯霉素作為胞外電子受體，供其呼吸生長(zhǎng).當(dāng)初始濃度較高時(shí)，氯霉素對(duì)S12的抑菌作用比較明顯，導(dǎo)致氯霉素去除率急劇下降.在S12/針鐵礦+氯霉素體系中，氯霉素的還原去除效果進(jìn)一步提高， 反應(yīng)10天后， 初始濃度為2 ppm的氯霉素被完全去除，5 ppm、10 ppm和20 ppm初始濃度的氯霉素也分別去除了87.5%、87.2%和77.2%.該反應(yīng)體系氯霉素的去除曲線的變化趨勢(shì)與S12+氯霉素體系也有明顯不同， 前3天氯霉素的下降幅度明顯趨緩， 第3～6天內(nèi)氯霉素的去除速率明顯加快，隨后又趨于平緩.對(duì)照?qǐng)D1中Fe(II)的變化趨勢(shì)，我們可以得出以下結(jié)論：S12在反應(yīng)初期主要以異化還原針鐵礦產(chǎn)生礦物結(jié)合Fe(II)為主，當(dāng)該活性Fe(II)濃度達(dá)到一定水平后，對(duì)氯霉素進(jìn)行快速還原去除，F(xiàn)e(II)被氧化成Fe(III)，導(dǎo)致S12/針鐵礦+氯霉素體系中Fe(II) 的產(chǎn)生量維持在較低水平.因此，S12異化還原針鐵礦產(chǎn)生的礦物結(jié)合Fe(II)是氯霉素降解去除的主要活性組分，與S12+氯霉素體系中S12是降解氯霉素的主要組分完全不同.S12/針鐵礦+氯霉素體系中的大部分氯霉素被還原降解，使該體系中的S12受到抗生素的抑菌作用明顯減輕，所以生物量比S12+氯霉素體系要高出許多.

(a)2 ppm CAP; (b)5 ppm CAP; (c)10 ppm CAP; (d)20 ppm CAP

圖2各反應(yīng)體系微生物生物量變化圖

(a)2 ppm CAP; (b)5 ppm CAP; (c)10 ppm CAP; (d)20 ppm CAP

圖3各反應(yīng)體系中氯霉素濃度變化圖

2.3 氯霉素對(duì)S12/針鐵礦異化還原體系中礦物變化的影響

S12/針鐵礦、S12/針鐵礦+氯霉素體系反應(yīng)10天后，將固體取出，經(jīng)冷凍干燥后，樣品采用XRD、SEM-EDS分析，以判斷反應(yīng)過(guò)程中是否發(fā)生了礦物晶型的變化.XRD分析結(jié)果如圖4所示，S12/針鐵礦體系出現(xiàn)了一組新的衍射峰，2θ角分別為11°、13°、18°、19°、21°、27°、29°、33°、34°、36°、38°和45°，這些峰的位置與標(biāo)準(zhǔn)藍(lán)鐵礦的衍射峰完全吻合.再經(jīng)SEM分析，該反應(yīng)體系出現(xiàn)了層狀菱形的新礦物(圖5B和5b)，這與針鐵礦的針狀類型完全不同(圖5A和5a). 對(duì)該新次生礦物進(jìn)一步作EDS分析，測(cè)得礦物中Fe、O和P等元素的含量分別為51.6%、38.5%和9.9%(圖6b和表1)，這三種元素的含量比與藍(lán)鐵礦比較相近.根據(jù)以上XRD和SEM-EDS分析結(jié)果，可以確定針鐵礦在S12的作用下發(fā)生了晶型變化，產(chǎn)生新的次生礦物藍(lán)鐵礦[11].

S12/針鐵礦+氯霉素體系中，當(dāng)氯霉素的濃度為2 ppm時(shí)，XRD圖上也出現(xiàn)了2θ角為13°、36°和45°的新衍射峰(圖4a)，峰的強(qiáng)度比S12/針鐵礦體系明顯減弱.SEM圖上也出現(xiàn)了新的礦物，但沒(méi)有明顯的層狀菱形礦物出現(xiàn)(圖5C和5c). 對(duì)礦物進(jìn)一步作EDS分析，測(cè)得Fe、O和P等元素的含量分別為45.7%、8.4%和45.9%(圖6c和表1)，相比S12/針鐵礦體系O元素的含量有所上升，P元素的含量有所下降.根據(jù)這一結(jié)果，可以判斷該反應(yīng)體系出現(xiàn)了微弱的藍(lán)鐵礦，其含量明顯低于S12/針鐵礦體系.對(duì)比其他三種S12/針鐵礦+氯霉素體系(包括氯霉素濃度為5 ppm、10 ppm和20 ppm)的XRD分析結(jié)果(圖4b、4c和4d)，圖中全部為針鐵礦的特征峰，并無(wú)其他新的衍射峰出現(xiàn).SEM圖中也沒(méi)有新的礦物出現(xiàn)，在低倍鏡下看到的只是經(jīng)冷凍干燥后針鐵礦的團(tuán)聚體(圖5C、5c、5D、5d、5E和5e).EDS分析也沒(méi)有P或其他新的元素(表1).根據(jù)以上結(jié)果，可以確定氯霉素對(duì)S12作用下針鐵礦向藍(lán)鐵礦的轉(zhuǎn)化具有明顯的抑制作用，當(dāng)氯霉素初始濃度較低時(shí)，氯霉素基本上都被礦物結(jié)合Fe(II)還原降解，抑制能力相對(duì)較弱.

表1 各體系反應(yīng)后固體樣品EDS能譜圖中各元素質(zhì)量百分比

3 結(jié)論

氯霉素對(duì)S12具有明顯的抑菌作用，從而在一定程度上抑制了S12對(duì)針鐵礦的異化還原，阻礙了異化鐵還原過(guò)程中針鐵礦向藍(lán)鐵礦的轉(zhuǎn)化.與此同時(shí)，S12異化還原針鐵礦產(chǎn)生的礦物結(jié)合Fe(II)是氯霉素還原降解的主要活性組分，能夠?qū)⒊跏紳舛葹? ppm的氯霉素完全降解，降解速率和效率比微生物還原要高出許多，極大地緩解了氯霉素對(duì)鐵還原菌的抑菌作用.通過(guò)本研究，我們首次發(fā)現(xiàn)了抗生素對(duì)鐵還原菌/鐵礦物異化還原的影響機(jī)制，以及異化鐵還原產(chǎn)生的活性組分對(duì)抗生素的降解作用.

(a)2 ppm CAP; (b)5 ppm CAP; (c)10 ppm CAP; (d)20 ppm CAP

圖4各反應(yīng)體系反應(yīng)后固體樣品的XRD圖

(A)(a)Goethite;(B)(b)S12/goethite;(C)(c)S12/goethite+CAP (2 ppm);

圖5各反應(yīng)體系反應(yīng)后固體樣品的SEM圖

(a)Goethite;(b)S12/goethite;(c)S12/goethite+CAP (2 ppm);(d)S12/goethite+CAP (5 ppm);

圖6各反應(yīng)體系反應(yīng)后固體樣品的SEM-EDS圖