不同劑量rESWT 對(duì)幼兔膝脛骨骺板生長(zhǎng)發(fā)育的影響

梁禮堪，劉小剛，龔飛，李建偉，黃建軍，唐慧淳，曹艷杰，張景春*

(1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原；2.山西省中醫(yī)院 骨關(guān)節(jié)科，山西 太原)

0 引言

ESWT 是一種經(jīng)濟(jì)和無(wú)創(chuàng)的物理療法，廣泛用于骨肌疾病的治療，但是在骺板周圍疾病的治療鮮有報(bào)道。兒童和青少年的骺板比周圍組織結(jié)構(gòu)更脆弱，如急性創(chuàng)傷及感染、腫瘤等原因均可對(duì)其造成不可逆轉(zhuǎn)的損害[1]，繼而導(dǎo)致肢體長(zhǎng)度不等長(zhǎng)、角度畸形或創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重者還會(huì)導(dǎo)致肢體的殘疾[2]。為減少骺板損傷導(dǎo)致的相關(guān)并發(fā)癥，近年國(guó)外學(xué)者開(kāi)展了ESWT 對(duì)骺板的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究并證實(shí)高劑量的ESWT 對(duì)骺板不造成損傷，但只有高劑量，劑量覆蓋面相對(duì)狹窄[3,4]；國(guó)內(nèi)專家不建議在兒科患者骺板周圍使用ESWT 進(jìn)行治療[5]，但并沒(méi)有對(duì)其骺板附近相關(guān)疾病的治療缺乏實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也沒(méi)有對(duì)其安全范圍作出評(píng)估。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同時(shí)間段低、中、高不同劑量rESWT 對(duì)幼齡家兔骺板影響，為確定ESWT 對(duì)骺板周圍治療的安全劑量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

新 西 蘭 幼 兔18 只，雌 雄 各 半，8～10 周 齡，體 重800-1000g，購(gòu)于太原康寶瑞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：[SCXK( 晉)2019-0002]，這些幼兔均未達(dá)到骨骼成熟[6]。于山西省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物房喂養(yǎng)，控制溫度為23±2℃，濕度：40～70%，光照和黑暗周期為12 小時(shí)。適應(yīng)性喂養(yǎng)三天后，按體重采用數(shù)字隨機(jī)量表分為低、中、高劑量組，每組3 只，雌雄不拘，單籠喂養(yǎng)，給予兔生長(zhǎng)飼料，隔日飼喂富含維C 的蔬菜。

1.2 rESWT 沖擊處理

將幼兔固定在兔架上，用STORZ MEDICAL( 瑞士 MASTERPULS MP100) 對(duì)幼兔右膝脛骨內(nèi)側(cè)沖擊，探頭參數(shù)：陶瓷探頭C15，沖擊前將沖擊部位毛發(fā)剃除，沖擊時(shí)未給麻醉處理，沖擊部位涂抹耦合劑( 亞達(dá) 江蘇華東醫(yī)療器械實(shí)業(yè)有限公司)，沖擊范圍的定位：以沖擊側(cè)膝關(guān)節(jié)間隙為標(biāo)準(zhǔn)向脛骨近端標(biāo)出縱向1cm 的長(zhǎng)度[7]，沖擊時(shí)不越過(guò)關(guān)節(jié)間隙及脛骨前正中線。所有幼兔沖擊由同一人操作，沖擊時(shí)左右移動(dòng)探頭，避免長(zhǎng)時(shí)間沖擊同一部位，且手持探頭壓力較低。分別于24 小時(shí)后(共沖擊1 次)、2 周(共沖擊3 次)、4 周(共沖擊5 次)分批處死幼兔。參照與人類相同治療劑量，設(shè)定治療參數(shù)：低(1bar)、中(2bar)、高(4bar) 三種劑量[8-9]，頻率：5Hz，沖擊次數(shù)：2000 次，療程：每周1 次。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 雙側(cè)小腿外形及長(zhǎng)度情況

沖擊后連續(xù)觀察3 天沖擊部位皮膚情況，每次沖擊前觀察沖擊部位是否腫脹及雙下肢外形有無(wú)畸形。小腿長(zhǎng)度以股骨內(nèi)髁及內(nèi)踝尖為骨性標(biāo)志，用軟尺測(cè)量股骨內(nèi)髁及內(nèi)踝尖的長(zhǎng)度。測(cè)量時(shí)將幼兔固定在兔架上，安撫幼兔讓其放松，保證所測(cè)量下肢保持在伸直位，由三名操作者用軟尺分別三次測(cè)量雙側(cè)小腿長(zhǎng)度，取其平均值。

1.3.2 膝關(guān)節(jié)脛骨近端骺板組織病理學(xué)觀察

對(duì)幼兔實(shí)施耳緣靜脈空氣栓塞處死后，將雙側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨近端骺板組織分離并取出，用游標(biāo)卡尺測(cè)得取出軟組織厚度為0.2～0.3cm。將取出組織置于甲酸- 鹽酸混合脫鈣液中浸泡72小時(shí)，脫鈣后保證用細(xì)針穿刺時(shí)無(wú)阻力感。脫鈣后將組織固定在10%的甲醛溶液中。再行脫水、石蠟包埋、切片(5μm)和蘇木精-伊紅(HE)染色，包埋時(shí)將骺板矢狀位等份切成3 等份。用萬(wàn)能熒光成像系統(tǒng)(BX51-DP72，日本 OLYMPUS)和ImageJ1.8.0 軟件分析和測(cè)量骺板、增殖層、肥厚層長(zhǎng)度及沖擊側(cè)骺板的內(nèi)、中、外側(cè)區(qū)域長(zhǎng)度，三次測(cè)量取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 22.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法為重復(fù)測(cè)量方差分析，P＞0.05 為差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙下肢分析

2.1.1 沖擊后皮膚及外形

低、中、高三種劑量沖擊后出現(xiàn)皮下瘀斑，但未見(jiàn)皮膚破潰，瘀斑在72 小時(shí)后消退。24 小時(shí)、2 周、4 周與未沖擊的對(duì)照側(cè)相比，沖擊部位未見(jiàn)腫脹、畸形生長(zhǎng)等異常改變。

2.1.2 雙側(cè)小腿長(zhǎng)度變化

24 小時(shí)、2 周、4 周與未沖擊的對(duì)照側(cè)比較，沖擊24 小時(shí)、2 周、4 周后雙側(cè)小腿長(zhǎng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各時(shí)間段小腿長(zhǎng)度變化(cm)

2.2 脛骨骺板病理學(xué)觀察

光鏡下觀察：100 倍顯示可見(jiàn)：低、中、高三種劑量沖擊24 小時(shí)、2 周、4 周后，相較于未沖擊的對(duì)照側(cè)，沖擊側(cè)骺板未見(jiàn)生長(zhǎng)紊亂的細(xì)胞，且沖擊側(cè)骺板增殖層細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照側(cè)增多，雙側(cè)鈣化層未見(jiàn)明顯改變，雙側(cè)骺板軟骨細(xì)胞柱呈直線生長(zhǎng)，均未見(jiàn)彎曲生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1～18；400 倍顯示可見(jiàn)：低、中、高三種劑量沖擊24 小時(shí)、2 周、4 周后均未見(jiàn)細(xì)胞骺板軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核固縮及核裂解，見(jiàn)圖19～21。采用ImageJ1.8.0 軟件分析和測(cè)量低、中、高三種劑量沖擊后幼兔雙側(cè)膝脛骨骺板、增殖層、肥厚層長(zhǎng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，且沖擊側(cè)骺板內(nèi)、中、外區(qū)域外骺板長(zhǎng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2～4。

表2 各時(shí)間段骺板長(zhǎng)度變化(um)

圖1 低劑量24 小時(shí)后右側(cè)骺板＊100

圖2 低劑量24 小時(shí)后左側(cè)骺板＊100

圖3 中劑量24 小時(shí)后右側(cè)骺板＊100

圖4 中劑量24 小時(shí)后左側(cè)骺板＊100

圖5 高劑量 24 小時(shí)后右側(cè)骺板＊100

圖6 高劑量 24 小時(shí)后左側(cè)骺板＊100

圖7 低劑量 2 周后右側(cè)骺板＊100

圖8 低劑量 2 周后左側(cè)骺板＊100

圖9 中劑量 2 周后右側(cè)骺板＊100

圖10 中劑量2 周后左側(cè)骺板＊100

圖11 高劑量2 周后右側(cè)骺板＊100

圖12 高劑量2 周后左側(cè)骺板＊100

圖13 低劑量4 周后右側(cè)骺板＊100

圖14 低劑量4 周后左側(cè)骺板＊100

圖15 中劑量4 周后右側(cè)骺板＊100

圖16 中劑量4 周后左側(cè)骺板＊100

圖17 高劑量4 周后右側(cè)骺板＊100

圖18 高劑量4 周后左側(cè)骺板＊100

圖19 低劑量 右側(cè)骺板＊400

圖20 中劑量 右側(cè)骺板＊400

圖21 高劑量 右側(cè)骺板＊400

表3 各時(shí)間段增殖層長(zhǎng)度變化(um)

表4 各時(shí)間段肥厚層長(zhǎng)度變化(um)

3 討論

根據(jù)波形，ESWT 有兩種類型，分別為fESWT 和rESWT[10]，rESWT 被認(rèn)為是治療骨科疾病的一種有效方法，如：假性血栓、足底筋膜炎、肱骨外上髁炎、肩部鈣化性腱炎、跟腱疾病和股骨頭壞死[9]。近年來(lái)，因rESWT 是一種經(jīng)濟(jì)、無(wú)創(chuàng)的物理療法，且臨床效果良好，其應(yīng)用逐漸增加[11]。Nassenstein 等人[3]證明，在用人類相同治療條件下的ESWT，不會(huì)對(duì)幼兔表皮產(chǎn)生損傷。但本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，低、中、高三種劑量rESWT 沖擊后所有幼兔均有不同程度的皮下淤血，但皮膚未見(jiàn)破潰，皮下淤血一般在72 小時(shí)消退。有研究表明[12]，ESWT 組織的副作用主要是由“空化效應(yīng)”導(dǎo)致皮膚毛細(xì)血管的損傷，能量越高，血管管徑越小，損傷的可能性越大，本驗(yàn)中幼兔的皮膚較薄，所以即使較低劑量也導(dǎo)致皮下淤血。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用rESWT 低、中、高劑量沖擊后，幼兔雙側(cè)小腿長(zhǎng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Kurzweil 等人[13]實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致。然而，Yeaman 等人[14]則認(rèn)為應(yīng)用ESWT 于大鼠脛骨近端可導(dǎo)致其肢體生長(zhǎng)遲緩。相關(guān)研究表明[15,16]，ESWT 對(duì)骺板損傷的機(jī)制可能與其直接沖擊效應(yīng)及沖擊后血管損傷導(dǎo)致血液循環(huán)障礙有關(guān)。相關(guān)ESWT 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)指出[3]，沖擊波誘導(dǎo)細(xì)胞和組織效應(yīng)取決于沖擊的次數(shù)和沖擊的能量，而本研究分別使用1bar、2bar、4bar 作為低、中、高劑量且沖擊次數(shù)為2000 次，相較而言，本實(shí)驗(yàn)沖擊次數(shù)相對(duì)少且采用rESWT 進(jìn)行沖擊，相較于其他實(shí)驗(yàn)所使用的fESWT，rESWT 缺少fESWT 的典型陡變效應(yīng)，rESWT 達(dá)到較低的能量密度，但處理面積更大[17]。Pazzaglia 等人[18]在對(duì)骺軟骨細(xì)胞研究中指出，軟骨細(xì)胞排列紊亂及細(xì)胞柱彎曲生長(zhǎng)會(huì)影響骺板的生長(zhǎng)發(fā)育乃至骨骼的生長(zhǎng)，而本實(shí)驗(yàn)使用低、中、高三種劑量rESWT 沖擊后，在100 倍光鏡下均未發(fā)現(xiàn)骺板軟骨細(xì)胞排列紊亂及骨橋的出現(xiàn)，低、中、高三種劑量在400 倍光鏡下均未發(fā)現(xiàn)骺板軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核裂解及固縮，這說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所取rESWT 沖擊能量范圍及沖擊次數(shù)不造成骺板損傷。

哺乳動(dòng)物長(zhǎng)骨的縱向及橫向生長(zhǎng)取決于骨的骺板。骺板中軟骨細(xì)胞按不同分化階段可分為靜止細(xì)胞層、增殖細(xì)胞層、肥大細(xì)胞層和鈣化層。其中增殖細(xì)胞層和肥大細(xì)胞層主要負(fù)責(zé)骨骼的增長(zhǎng)[1]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低、中、高三種劑量沖擊后，沖擊側(cè)骺板增殖層細(xì)胞數(shù)量較未經(jīng)沖擊的對(duì)照側(cè)明顯增多，提示沖擊側(cè)增殖層細(xì)胞的有絲分裂更為旺盛。ESWT 導(dǎo)致增殖層細(xì)胞分裂旺盛、數(shù)量增多的具體機(jī)制尚不清楚，可能與ESWT 刺激骺板端生成更多的血管有關(guān)，有利于骺板生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子從周圍的血管運(yùn)輸?shù)谨堪逯衃19]，從而有利于骺板軟骨細(xì)胞增殖。王克杰等人[20]報(bào)道了低劑量ESWT 對(duì)兔腱-骨結(jié)合部新生血管形成的影響，與對(duì)照組相比，低劑量ESWT 處理的肌腱具有更多的新血管和血管生成相關(guān)標(biāo)記物。Ozturk[4]等人研究發(fā)現(xiàn)，高劑量fESWT 能刺激骺板的生長(zhǎng)，但Saisu[21]等人用高劑量fESWT 沖擊家兔股骨出現(xiàn)過(guò)骨折結(jié)果，Johannes[22]等人通過(guò)fESWT 對(duì)懸浮細(xì)胞的研究表明低數(shù)量、高劑量的沖擊波更適合臨床的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)選用低、中、高不同劑量rESWT 沖擊幼兔骺板，發(fā)現(xiàn)其不僅能刺激細(xì)胞增生，且未見(jiàn)骨折等并發(fā)癥，其原因是rESWT 作用較fESWT 更為緩和。本實(shí)驗(yàn)雖未發(fā)現(xiàn)鈣化層的變化，但Saisu 等人[21]研究了ESWT 對(duì)未成熟兔長(zhǎng)骨中骨礦物質(zhì)含量的影響，表明了ESWT 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞數(shù)量、密度增加，這有利于鈣化層細(xì)胞的骨化。

骺板生長(zhǎng)過(guò)程中軟骨細(xì)胞需要不斷補(bǔ)充，Koji M 等人[23]研究表示骺板軟骨細(xì)胞由靜止區(qū)干細(xì)胞分化而來(lái)，這些細(xì)胞跨越整個(gè)生長(zhǎng)板的增殖和肥大軟骨細(xì)胞的形成，本研究用rESWT 沖擊后增殖區(qū)細(xì)胞數(shù)量增多，其作用機(jī)制是否是促進(jìn)靜止區(qū)干細(xì)胞的增殖，使更多干細(xì)胞分化為增殖層細(xì)胞有待于進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究中發(fā)現(xiàn)沖擊側(cè)骺板的內(nèi)、中、外區(qū)域長(zhǎng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這也從側(cè)面解釋了本實(shí)驗(yàn)中幼兔沖擊側(cè)未見(jiàn)腫脹及下肢的畸形生長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)表明在一定范圍內(nèi)的能量rESWT 不會(huì)破壞骺板的生長(zhǎng)，可使骺板增殖層軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，雖骺板長(zhǎng)度無(wú)變化，但骺板增殖層細(xì)胞數(shù)量的增多可能促進(jìn)骨的縱向生長(zhǎng)，但本實(shí)驗(yàn)存在樣本量小、觀察時(shí)間短等不足，需要進(jìn)一步更長(zhǎng)周期的實(shí)驗(yàn)研究。所以在將rESWT 應(yīng)用于臨床小兒骨科實(shí)踐之前，還需進(jìn)一步研究，以確定其對(duì)骨骺生長(zhǎng)的最佳參數(shù)。