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    TPPU 對(duì)缺血性腦卒中大鼠AQP4 蛋白的影響

    2020-05-23 05:14:20黃攀張琳蕾易興陽韓釗
    關(guān)鍵詞:造模腦缺血缺血性

    黃攀,張琳蕾,易興陽*,韓釗*

    (1.德陽市人民醫(yī)院,四川 德陽;2. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院,浙江 溫州)

    0 引言

    缺血性卒中是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病,發(fā)病率高,占所有腦卒中的80%左右,溶栓治療和神經(jīng)保護(hù)治療是其兩大主要治療策略。然而,迄今尚無有效的神經(jīng)保護(hù)劑獲得臨床指南推薦[1,2],但是人類研發(fā)有效神經(jīng)保護(hù)劑的探索一直沒有終止。1-三氟甲氧基苯基-3(1-丙酰哌啶-4-基)脲[1-trifluoromethoxyphenyl-3-(1 -propionyl-piperidin-4-yl)urea,TPPU] 是2012 年由加利福尼亞大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院分子生物科學(xué)中心Bruce 教授等合成的一種新型sEH 抑制劑[3],在多種動(dòng)物模型中顯示其在抗炎和心、腎保護(hù)方面均優(yōu)于傳統(tǒng)sEH 抑制劑[4]。心臟動(dòng)物模型研究也表明[5],TPPU可預(yù)防心肌梗死后心肌纖維化,具有抗凋亡、抗氧化、保護(hù)線粒體等多種功能。但TPPU 在腦缺血后神經(jīng)保護(hù)作用研究少,TPPU 是否具有腦保護(hù)作用。因此本試驗(yàn)主要探討TPPU 對(duì)缺血性大鼠水通道蛋白(AQP4)及神經(jīng)功能的影響。

    1 研究方法

    1.1 pMCAO 模型的制備

    選取250-300g 左右的成年雄性SD 大鼠,采用Longa 線栓法制作。參照本研究小組以往的方法,水合氯醛(350mg/kg,腹腔注射)麻醉后,手術(shù)顯微鏡下分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA),頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA),充分游離ECA 主干,電凝其遠(yuǎn)端并切斷,在殘端剪一小口。采用0.26mm 尼龍魚線頭端去棱角鈍化處理作為線栓,將制備好的尼龍栓線插入ICA 顱內(nèi)段,當(dāng)遇到輕微阻力時(shí)停止,結(jié)扎ECA 根部絲線。尼龍絲線插入深度為19-22mm,造成大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,讓線栓持續(xù)阻塞,不拔出線栓,直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。假手術(shù)組線栓插入深度為10mm,栓線頭端停留于ICA 內(nèi)。術(shù)后將動(dòng)物置于放有清潔墊料的飼養(yǎng)盒,自由飲水、進(jìn)食。在這些操作過程中,體溫保持在(37±0.5)°C。局部腦血流量(rCBF) 可借助軟質(zhì)探針和激光多普勒血流測定儀進(jìn)行測量。此模型制備操作簡便、副損傷小、梗死灶部位恒定,可以滿足研究的要求。

    1.2 實(shí)驗(yàn)分組(每組12 只)

    設(shè)空白對(duì)照組、pMCAO 模型組(pMCAO+DMSO)、pMCAO 模型+TPPU 給藥組。pMCAO 模型+TPPU 給藥組按照TPPU 濃度劑量分為為0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg 共4 個(gè)亞組。

    1.3 干預(yù)方法

    空白對(duì)照組、假手術(shù)組和MCAO 模型組均由腹腔注射相應(yīng)劑量生理鹽水,pMCAO 模型+ TPPU 給藥組造模后即刻由腹腔注射相應(yīng)濃度劑量的TPPU 干預(yù)。各組在造模后2h,進(jìn)行Longa 法神經(jīng)功能缺損評(píng)分,判斷模型成功與否。0 分:正常,無神經(jīng)損傷征象;1 分:動(dòng)物不能完全伸展右前肢;2 分:動(dòng)物右側(cè)肢體癱瘓,行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈,出現(xiàn)追尾現(xiàn)象;3 分:行走時(shí)向右側(cè)跌倒,或動(dòng)物不能站立或動(dòng)物打滾;4 分:無自發(fā)活動(dòng),有意識(shí)障礙。神經(jīng)功能缺損評(píng)分1-3 分為造模成功,0 分和4 分為造模不成功予以剔除,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充剔除的動(dòng)物,保證每組動(dòng)物數(shù)量。

    1.4 觀測指標(biāo)

    pMCAO 后24h 測定下列指標(biāo)并進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)比較分析:

    1.4.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

    造模后2h、24h(處死動(dòng)物前)采用Longa 法進(jìn)行評(píng)分。

    1.4.2 采用干濕質(zhì)量法

    腦缺血24h 后處死大鼠,快速斷頭取腦,濾紙擦去表面水分,取缺血側(cè)半邊大腦,置天平內(nèi)精密稱取濕質(zhì)量,然后置110℃電烤箱24h,再迅速測干質(zhì)量。計(jì)算腦含水量用濕重的百分比表示為:( 濕重- 干重)/ 濕重×100%。采用Western-blot 法檢測AQP4 蛋白的表達(dá)量。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用T 檢驗(yàn),以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

    造模后2h、24h(處死動(dòng)物前)采用Longa 法進(jìn)行評(píng)分,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Pmcao+DMSO 組比較,pMCAO+0.5mg/kg 組、pMCAO+2.0mg/kg 組 差 異 無 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義(P>0.05),而pMCAO+1.0mg/kg 組、pMCAO+1.5mg/kg 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2 各組腦組織AQP4 蛋白比較

    與 Pmcao+DMSO 組 比 較,pMCAO+1.5mg/kg 組、pMCAO+2.0mg/kg 組 差 異 無 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義(P>0.05),而pMCAO+0.5mg/kg 組、pMCAO+1.0mg/kg 組 差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意義(P<0.05)。

    3 討論

    圖1 各組mNSS 評(píng)分比較

    花生四烯酸(arachidonic acid,AA) 是人體內(nèi)心腦血管活性物質(zhì)的前體,其代謝產(chǎn)物與腦血管病的發(fā)病密切相關(guān)[5]。AA的細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP) 代謝通路是近年研究的熱點(diǎn)[6]。AA 在CYP 羥化酶作用下生成羥基二十碳四烯 酸(hydroxyeicosatetraenoic acid,HETEs),在CYP 表 氧 化酶作用下生成環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acid,EETs),EETs 再經(jīng)過可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH) 作用下生成生物活性較弱的二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acid,DHETs)。HETEs 具有強(qiáng)力的腦血管收縮作用和促動(dòng)脈粥樣硬化作用。而EETs 具有擴(kuò)血管、調(diào)節(jié)離子通道、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物學(xué)功能,對(duì)心腦血管具有保護(hù)作用。我們近期臨床研究發(fā)現(xiàn),AA 的CYP 代謝通路代謝產(chǎn)物(EETs 和HETEs) 水平與急性缺血性卒中后神經(jīng)功能惡化密切相關(guān)[7,8],提示它們在腦缺血性損傷中可能發(fā)揮重要作用。

    血腦屏障(BBB) 的破壞是缺血性卒中的重要病理機(jī)制。星型膠質(zhì)細(xì)胞參與對(duì)BBB 完整性的維持障礙。AQP4 主要分布于星型膠質(zhì)細(xì)胞足突,是介導(dǎo)水進(jìn)入腦組織的最主要蛋白。腦缺血損傷后,AQP4 表達(dá)升高,水通道開放,大量水分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)形成細(xì)胞內(nèi)水腫,引起血腦屏障破壞。c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38 MAPK 信號(hào)通路參與對(duì)水通道蛋白4 的調(diào)控。近年研究表明,細(xì)胞凋亡在腦缺血中可能起主導(dǎo)作用,腦缺血損傷后缺血半暗帶產(chǎn)生的主要病理生理機(jī)制之一是細(xì)胞凋亡,線粒體結(jié)構(gòu)和功能改變在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[9]。腦缺血后NCU 和BBB 損傷的線粒體細(xì)胞凋亡信號(hào)通路是目前關(guān)注的熱點(diǎn)。

    本研究結(jié)果表明,不同劑量的TPPU 對(duì)缺血性腦卒中神經(jīng)血管單元具有保護(hù)作用,調(diào)控水通道蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響血腦屏障進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)血管單元是其可能機(jī)制之一。

    圖2 各組AQP4 蛋白比較

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