IL-4、VCAM-1、VEGF與VEGFR2在MDCK細(xì)胞中的表達(dá)分布

冶 金，楊 琨，阿依木古麗，喬自林，柏家林＊

（1．西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；2．西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3．西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

犬腎傳代細(xì)胞系（Madin Darby canine kidney，MDCK）由Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel母曲架犬腎臟組織中分離培育建立，是通常以貼壁方式培養(yǎng)的上皮樣細(xì)胞[1,2]。MDCK細(xì)胞廣泛應(yīng)用于呼腸弧病毒、腺病毒和禽流感病毒等多種病毒的分離、純化及擴(kuò)增，對于不同流感病毒株的普遍敏感性使MDCK細(xì)胞被公認(rèn)為是適于流感疫苗生產(chǎn)的重要細(xì)胞基質(zhì)之一[3-5]。目前，國外已有多家公司生產(chǎn)的MDCK細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)證批準(zhǔn)上市[2,6]，而國內(nèi)的流感疫苗生產(chǎn)則還處于傳統(tǒng)的雞胚生產(chǎn)，主要是因?yàn)镸DCK細(xì)胞成瘤安全性問題。白介素4（Interleukin 4，IL-4）、血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子（VCAM-1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR2）是四種不同的細(xì)胞因子[7-11]，均與細(xì)胞成瘤過程相關(guān)。本文通過應(yīng)用免疫組化SP法檢測MDCK細(xì)胞中IL-4、VCAM-1、VEGF、VEGFR2四種細(xì)胞因子蛋白的表達(dá)及分布狀況，為研究MDCK細(xì)胞內(nèi)源性蛋白表達(dá)及功能作用提供數(shù)據(jù)支持，為探究四種細(xì)胞因子蛋白與MDCK細(xì)胞成瘤性之間的聯(lián)系奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞：MDCK貼壁細(xì)胞（P-63），由甘肅省動(dòng)物細(xì)胞創(chuàng)新中心提供。主要試劑：新生牛血清，購自蘭州民海生物工程有限公司；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和PBS緩沖液，購自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司；組織細(xì)胞固定液（4%多聚甲醛），購自北京索萊寶科技有限公司；免疫組化染色試劑盒、Rabbit Anti-IL4l1 Polyclonal Antibody、Rabbit Anti-VCAM-1 Polyclonal Antibody、Rabbit Anti-VEGF Polyclonal Antibody、Rabbit Anti-VEGFR2 Polyclonal Antibody，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒和蘇木素染液，購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇及傳代 從液氮中取出細(xì)胞凍存管，置于37℃水浴中快速晃動(dòng)融解凍存管中細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液接種至含有20 ml新鮮DMEM（含10% 新生牛血清）培養(yǎng)基的T-25細(xì)胞瓶中，吹打均勻后置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。為減小DMSO 對細(xì)胞的損傷，在細(xì)胞培養(yǎng)4～8 h內(nèi)更換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.2 細(xì)胞爬片制備 胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中，充分吹打使之成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)；將蓋玻片置于6孔板中，按1×106/ml 的密度將單細(xì)胞懸液接種于6孔板中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.2.3 免疫組化SP法染色 取出細(xì)胞爬片，用PBS緩沖液輕洗細(xì)胞5 min；加入組織細(xì)胞固定液（4%多聚甲醛）室溫固定細(xì)胞20 min；加入0.5% Triton X-100（PBS緩沖液配制）浸泡20 min；滴加3% H2O2室溫孵育15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；滴加封閉用正常山羊血清工作液室溫孵育15～20 min，傾去；滴加適當(dāng)比例的一抗上，37℃ 孵育2 h或4℃過夜孵育；PBS緩沖液沖洗3遍；滴加生物素化二抗工作液，37℃或室溫孵育15～20 min；PBS緩沖液沖洗3遍；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育15～20 min；PBS緩沖液沖洗3遍；DAB 顯色，鏡下觀察適時(shí)終止（自來水沖終止）；自來水沖洗，蘇木素復(fù)染室溫30 s；自來水沖洗返藍(lán)15 min；梯度酒精脫水；二甲苯透明后用中性樹膠封片。

2 結(jié)果

在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖中，MDCK細(xì)胞核著色為藍(lán)色；IL-4（見圖1）、VCAM-1（見圖2）、VEGF（見圖3）、VEGFR2（見圖4）四種蛋白結(jié)合其對應(yīng)的抗體著色為褐色，褐色深淺表現(xiàn)蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)弱，實(shí)驗(yàn)陰性對照（見圖5）只對MDCK細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行染色。IL-4在MDCK細(xì)胞中著色均一，在胞核及胞質(zhì)中均有表達(dá)，呈彌漫性分布，定位于MDCK細(xì)胞胞漿中；VCAM-1、VEGF和VEGFR2則都呈片塊性分布，在胞膜及胞質(zhì)中表達(dá)，且VCAM-1、VEGF和VEGFR2均為胞膜強(qiáng)于胞質(zhì)中表達(dá)，定位于MDCK細(xì)胞胞膜上。

圖1 IL-4在MDCK細(xì)胞中的染色

圖2 VCAM-1在MDCK細(xì)胞中的染色

圖3 VEGF在MDCK細(xì)胞中的染色

圖4 VEGFR2在MDCK細(xì)胞中的染色

圖5 MDCK細(xì)胞陰性對照染色

（圖1、圖2、圖3、圖4分別為IL-4、VCAM-1、VEGF、VEGFR2蛋白在MDCK細(xì)胞中的染色結(jié)果；圖5為陰性對照，只對MDCK細(xì)胞核進(jìn)行染色，標(biāo)尺均為20 μm）

3 討論

IL-4是由Th2型細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，是一種多效應(yīng)細(xì)胞因子，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)IL-4參與細(xì)胞成瘤進(jìn)程并抑制腫瘤免疫[12,13]；VCAM-1為血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子，分布于細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)中，其表達(dá)強(qiáng)弱與腫瘤細(xì)胞遷移與擴(kuò)散有關(guān)[14]；VEGF為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、VEGFR2為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體，均與腫瘤細(xì)胞生長有關(guān)[15]。目前國外已有基于MDCK細(xì)胞生產(chǎn)的人用流感疫苗相繼上市[16]，而國內(nèi)目前還處于臨床試驗(yàn)階段，MDCK細(xì)胞作為疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞系，其成瘤性密切關(guān)聯(lián)疫苗質(zhì)量安全問題。已驗(yàn)證IL-4、VCAM-1、VEGF、VEGFR2四種細(xì)胞因子蛋白在MDCK細(xì)胞中表達(dá)及分布，但是否影響MDCK細(xì)胞成瘤還需進(jìn)一步研究。