柱后還原-高效液相色譜法同時(shí)測定調(diào)制乳粉中維生素K1和維生素K2

孫珊珊, 公丕學(xué), 張艷俠, 王明棟, 盧蘭香, 李新玲, 薛 霞, 劉艷明*, 張 峰

(1. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院, 山東 濟(jì)南 250101; 2. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院, 北京 100176)

維生素K又叫凝血維生素,是一類具有葉綠醌生物活性的萘醌類化合物,是肝內(nèi)合成凝血酶原的必需物質(zhì),參與止血、骨代謝和細(xì)胞生長,當(dāng)體內(nèi)缺乏時(shí)可造成凝血障礙,還具有降血脂、軟化血管、預(yù)防骨質(zhì)疏松等諸多功能,是人體必需的脂溶性維生素[1,2]。天然存在的維生素K有維生素K1(植物甲萘醌,VK1)和維生素K2(甲萘醌類,VK2)兩種,廣泛存在于自然界中,與人體代謝密切相關(guān),也是研究及應(yīng)用最多的兩類化合物[3,4]。維生素K1和維生素K2都是脂溶性維生素,對(duì)光和堿敏感,有一定的耐熱性,在生物體內(nèi)具有不同強(qiáng)度的生物活性[5]。維生素K1為單一化合物,其側(cè)鏈上只包含有一個(gè)異戊烯結(jié)構(gòu)單元,主要來源于綠葉蔬菜(如菠菜、甘藍(lán)、萵苣等)與大豆及其制品[6]。維生素K2由腸道細(xì)菌合成,另外納豆、蛋黃、動(dòng)物肝臟、發(fā)酵品中少量含有[7],維生素K2是由一個(gè)甲基萘醌母核和一條C3位帶有異戊二烯側(cè)鏈組成的系列化合物,根據(jù)側(cè)鏈上異戊二烯長短不同共有14種同系物,其中維生素K2(35)亦稱為甲萘醌-7(MK-7),是維生素K2中功能最廣泛、活性最強(qiáng)大、作用最持久、成分最安全的一種[8]。

維生素K1和維生素K2作為一種營養(yǎng)補(bǔ)充劑應(yīng)用到調(diào)制乳粉中,對(duì)于維生素K缺乏癥有很好的預(yù)防作用。而維生素K1是目前國內(nèi)主要的營養(yǎng)強(qiáng)化劑,維生素K2現(xiàn)在處于剛發(fā)展階段。2016年國家衛(wèi)計(jì)委第8號(hào)公告中批準(zhǔn)將維生素K2(35)作為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑在調(diào)制乳粉中添加使用[9],在美國、歐洲及我國臺(tái)灣地區(qū)早已批準(zhǔn)維生素K2作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑添加,在各類食品中根據(jù)實(shí)際需要添加。因此目前國內(nèi)維生素K2在食品中的應(yīng)用相對(duì)較少。

國內(nèi)對(duì)食品中維生素K1的檢測研究較多,而食品中維生素K2的檢測,維生素K1和維生素K2的同時(shí)檢測方法相對(duì)較少。維生素K1和維生素K2的檢測方法主要有分光光度法[10]、液相色譜-紫外檢測法[11-13]、液相色譜-熒光檢測法[14-17]、液相色譜-質(zhì)譜法[18-20]等。其中分光光度法分析步驟繁瑣,且精密度不高;高效液相色譜-紫外檢測法選擇性和靈敏度不高,無法滿足食品中微痕量組分的檢測需求;高效液相色譜-質(zhì)譜法雖然具有較高的靈敏度,但其儀器復(fù)雜、成本較高,而且食品基質(zhì)復(fù)雜,易影響定量準(zhǔn)確性。高效液相色譜-熒光檢測方法(HPLC-FLR)靈敏度高,特異性強(qiáng),維生素K的不飽和酮結(jié)構(gòu)共軛體系小,其本身并不能產(chǎn)生熒光,通過柱后鋅粉還原使維生素K同系物的母核萘醌環(huán)發(fā)生熒光反應(yīng),產(chǎn)生熒光物質(zhì)[21],從而提高其在高效液相色譜熒光檢測上的靈敏度和選擇性。

目前,液相色譜-熒光檢測同時(shí)檢測調(diào)制乳粉中維生素K1和維生素K2含量的方法鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用柱后鋅粉還原-高效液相色譜-熒光檢測方法對(duì)調(diào)制乳粉中的維生素K進(jìn)行研究,建立了定性定量準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、特異性強(qiáng)的一種高效液相色譜-熒光檢測同時(shí)測定維生素K1和維生素K2的檢測方法,對(duì)調(diào)制乳粉中營養(yǎng)強(qiáng)化劑維生素K1和維生素K2的檢測、應(yīng)用和監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters高效液相色譜儀(帶熒光檢測器)、Xbridge C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm)(美國Waters公司);鋅粉還原柱(50 mm×4.6 mm,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司); 3-18K型冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司); AB204-S型電子天平(德國Mettler Toledo公司); MS3型旋渦混合器(德國IKA公司); SB-800DTD超聲清洗儀、SW22恒溫水浴振蕩器(中國寧波新芝生物科技股份有限公司); HGC-24型氮吹儀(中國恒奧科技有限公司); Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr. Ehrenstorfer公司);維生素K2標(biāo)準(zhǔn)品(美國ChromaDex公司)。甲醇、正己烷、二氯甲烷(色譜純,德國Merck公司);冰乙酸(色譜純,天津市康科德科技有限公司);無水乙醇、氯化鋅、氯化鈉、乙酸鈉、氫氧化鈉(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);碳酸鉀(優(yōu)級(jí)純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。脂肪酶(酶活力≥700 U/mg,美國Sigma公司);實(shí)驗(yàn)用調(diào)制乳粉購自超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取維生素K1和維生素K2標(biāo)準(zhǔn)品各 0.010 0 g,置于10 mL容量瓶中,用正己烷溶解并定容,配制 1 000 μg/mL 維生素K1、維生素K2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,充分搖勻,在棕色試劑瓶中于-18 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

分別吸取一定量的維生素K1和維生素K2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,氮?dú)獯蹈珊?用甲醇稀釋,混勻,配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇逐級(jí)稀釋成 0.002 5、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0和2.0 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

稱取2.5 g樣品,置于50 mL離心管中,加入0.8 g脂肪酶,用10 mL溫水溶解,渦旋混勻,于(37±2) ℃恒溫水浴振蕩,酶解4 h后,取出加入1 mL 2.5 mol/L 氫氧化鈉溶液,渦旋30 s后,再加入10 mL無水乙醇,充分混勻,進(jìn)行皂化反應(yīng)。加入10 mL正己烷,渦旋提取5 min,以 6 000 r/min 離心3 min,移取上層正己烷層于另一個(gè)50 mL離心管中,再加入10 mL正己烷萃取一次,合并提取液,用10 mL飽和氯化鈉溶液水洗有機(jī)相后氮?dú)獯蹈?用甲醇2 mL復(fù)溶,過0.22 μm有機(jī)濾膜,待液相色譜測定。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均避光操作。

1.4 分析條件

色譜柱:Xbridge C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm);柱后鋅粉還原柱(50 mm×4.6 mm);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:甲醇溶液(含0.03%(v/v)冰乙酸、1.5 g/L 氯化鋅和0.5 g/L 無水乙酸鈉);流速1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;熒光檢測:激發(fā)波長(λex)326 nm,發(fā)射波長(λem)432 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 熒光條件的優(yōu)化

維生素K本身不帶熒光,經(jīng)鋅粉還原后產(chǎn)生熒光物質(zhì)進(jìn)行檢測。當(dāng)有鋅離子存在時(shí),維生素K可以通過鋅柱被還原后產(chǎn)生熒光物質(zhì),為了提高被測樣品在高效液相色譜-熒光檢測器上的響應(yīng)值,提高靈敏度,必須選擇合適的激發(fā)波長和發(fā)射波長。本文采用Waters 2475熒光檢測器的三維(3D)掃描功能,對(duì)鋅粉還原后的維生素K1和維生素K2混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行激發(fā)光譜和發(fā)射光譜掃描。

結(jié)果如圖1a所示,固定發(fā)射波長為430 nm,在200～420 nm激發(fā)光譜下掃描還原后的維生素K1和維生素K2,得到二者的激發(fā)波長為243 nm和326 nm,其中還原后維生素K1和維生素K2在λex為326 nm時(shí)的響應(yīng)值約是λex為243 nm時(shí)的1.5倍,因此選擇λex為326 nm。如圖1b所示,固定λex為326 nm,在336～610 nm波長范圍內(nèi)掃描發(fā)射光譜,得到最佳λem為432 nm。因此通過分析，選擇最佳λex為326 nm,最佳λem為432 nm。

圖 1 還原后維生素K1和維生素K2的(a)激發(fā)光譜和(b)熒光光譜圖Fig. 1 (a) Excitation and (b) fluorescence spectra of the vitamin K1(VK1) and vitamin K2(VK2) after reduction a. emission wavelength (λem)=430 nm; b. excitation wavelength (λex)=326 nm.

2.1.2 色譜柱和流動(dòng)相

圖 2 維生素K1和維生素K2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 μg/mL)的色譜圖Fig. 2 Chromatogram of the VK1 and VK2 in the mixed standard solution (1.0 μg/mL)

維生素K1和維生素K2脂溶性較強(qiáng),具有弱極性,其在反相色譜柱上保留很強(qiáng),容易導(dǎo)致峰寬拓展,峰形鈍化,影響測定的靈敏度。本文采用含0.03%(v/v)冰乙酸、1.5 g/L 氯化鋅和0.5 g/L 無水乙酸鈉的甲醇溶液為流動(dòng)相(pH為6.0±0.1),通過Xbridge C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm)進(jìn)行分離,鋅粉還原柱還原后熒光檢測器檢驗(yàn)。由圖2可見,維生素K1和維生素K2的峰高、峰形較理想,出峰時(shí)間早,縮短了分析檢測時(shí)間。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本文以調(diào)制乳粉為研究對(duì)象進(jìn)行前處理?xiàng)l件的優(yōu)化考察,將一定量的含維生素K1和維生素K2的營養(yǎng)添加劑添加到不含目標(biāo)物的空白兒童配方奶粉中,充分混勻,得到維生素K1和維生素K2含量均為75 μg/100 g的自制標(biāo)準(zhǔn)樣品。乳粉中富含蛋白質(zhì)和脂肪,維生素K1和維生素K2是脂溶性維生素,被包裹在乳粉顆粒中,不易直接提取,需要酶解、皂化,將其釋放,經(jīng)正己烷提取,濃縮復(fù)溶檢測。

圖 4 氫氧化鈉溶液(2.5 mol/L)的加入量對(duì)維生素K1和維生素K2回收率的影響(n=3)Fig. 4 Effect of volumes of sodium hydroxide solution (2.5 mol/L) on the recoveries of the VK1 and VK2(n=3)

2.2.1 酶解條件的優(yōu)化

酶解是調(diào)制乳粉中維生素K提取過程的重要環(huán)節(jié)之一,脂肪酶可將調(diào)制乳粉中的脂質(zhì)降解成脂肪酸和甘油三酯。本文通過考察脂肪酶用量和酶解時(shí)間,對(duì)調(diào)制乳粉中維生素K1和維生素K2的提取效率進(jìn)行考察。

脂肪酶的用量直接影響提取效率,不同酶解條件對(duì)維生素K1和維生素K2的影響趨勢基本一致。實(shí)驗(yàn)考察了酶解過夜的條件下,不同脂肪酶的使用量,由圖3a可見,脂肪酶的添加量為0.8 g時(shí),維生素K1和維生素K2的回收率最高,分別為93%和91% 。脂肪酶用量不足,萃取時(shí)乳化嚴(yán)重,影響提取效率;脂肪酶使用過量會(huì)降低維生素K的提取效率,可能原因是酶使用量太高不利于乳粉的溶解,導(dǎo)致回收率下降。

當(dāng)酶的添加量為0.8 g時(shí),實(shí)驗(yàn)對(duì)不同酶解時(shí)間進(jìn)行了考察。由圖3b可見,酶解時(shí)間過短,酶解不完全,影響后續(xù)提取效率。酶解時(shí)間4 h以上,提取效率趨于穩(wěn)定,回收率均達(dá)到90%以上。實(shí)驗(yàn)最終選擇0.8 g的脂肪酶酶解4 h。

圖 3 (a)脂肪酶用量和(b)酶解時(shí)間對(duì)維生素K1和維生素K2回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of (a) dosage of lipase and (b) enzymolysis time on the recoveries of the VK1 and VK2(n=3)

2.2.2 皂化條件的優(yōu)化

乳粉中維生素K經(jīng)酶解后,通過皂化將脂肪酸變成水溶性脂肪酸鈉,使脂溶性維生素K游離出來[22]。皂化條件,包括堿的加入量、皂化溫度與皂化時(shí)間等,直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。如圖4所示，本文對(duì)皂化條件中堿液(2.5 mol/L 的氫氧化鈉溶液)的使用量進(jìn)行了考察。結(jié)果表明,氫氧化鈉溶液加入量為1 mL時(shí)的提取效率較好,維生素K1和維生素K2的回收率分別達(dá)到93%和92% 。氫氧化鈉溶液加入量過少時(shí),皂化不完全,液液萃取時(shí)不容易分層;加入量過多時(shí),維生素K被堿破壞,均會(huì)影響提取效率。堿加入后,渦旋30 s后再加入10 mL無水乙醇,乙醇可以保護(hù)維生素K,還可以起到消泡作用和促進(jìn)分層的作用。故本實(shí)驗(yàn)在酶解后的樣液中加入1 mL 2.5 mol/L 氫氧化鈉溶液,渦旋30 s后,再加入10 mL無水乙醇進(jìn)行皂化。

2.2.3 萃取條件的優(yōu)化

脂溶性維生素需采用有機(jī)溶劑萃取法進(jìn)行提取,本文使用有機(jī)溶劑正己烷通過液液分配將維生素K1和維生素K2萃取出來；維生素K1和維生素K2在堿性條件下不穩(wěn)定,水洗可以把萃取溶劑正己烷中微溶的堿液洗掉，選用飽和氯化鈉溶液作為水洗溶液,即可防止液液分配過程的乳化,更有利于分層。本文同時(shí)對(duì)正己烷的用量(10 mL和15 mL)和萃取次數(shù)(1次和2次)進(jìn)行了考察(見表1)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),采用正己烷10 mL或15 mL萃取2次，結(jié)果差異不大,對(duì)維生素K1和維生素K2的提取回收率均達(dá)到90%以上,但2次萃取對(duì)維生素K1和維生素K2的提取更充分。因此,從提高前處理效率和成本的角度,采用萃取條件為10 mL正己烷萃取2次。

表 1 萃取條件對(duì)維生素K1和維生素K2提取回收率的影響(n=3)Table 1 Effect of extraction conditions on the extraction recoveries of the VK1 and VK2(n=3)

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 線性范圍和檢出限

將濃度分別為 0.002 5、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0和2.0 μg/mL 的維生素K1和維生素K2混合標(biāo)準(zhǔn)工作液注入液相色譜儀,按1.4節(jié)的液相色譜條件進(jìn)行測定,以峰面積(y)為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(x, μg/mL)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以3倍和10倍信噪比(S/N)確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

結(jié)果表明,維生素K1在 0.002 5～2.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)(R2)>0.999,線性回歸方程為y=2.37×106x-2.18×103, LOD和LOQ分別為0.07 μg/100 g和0.2 μg/100 g;維生素K2在0.01～2.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,R2>0.999,線性回歸方程為y=1.55×106x-1.15×104, LOD和LOQ分別為0.24 μg/100 g和0.8 μg/100 g。

2.3.2 加標(biāo)回收率和精密度

分別以低(5 μg/100 g)、中(50 μg/100 g)、高(100 μg/100 g)3個(gè)水平向空白樣品中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加試驗(yàn),每個(gè)水平平行測定6次,考察方法的回收率與精密度,結(jié)果見表2。方法的平均回收率為80.39% ～94.39% ,精密度為0.85% ～3.98% ,表明方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表 2 方法的回收率和精密度(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs for the method (n=6)

2.4 實(shí)際樣品檢測

按照實(shí)驗(yàn)選擇的最優(yōu)條件對(duì)市售的10份兒童乳粉和10份孕產(chǎn)婦乳粉進(jìn)行分析。檢測結(jié)果顯示:其中16份樣品檢出維生素K1,含量范圍在35～70 μg/100 g之間,符合標(biāo)示值及國家標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定值,其余4份未檢出;維生素K2均未檢出,推測原因是調(diào)制乳粉中維生素K添加劑僅為維生素K1,而維生素K2作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑處于發(fā)展階段,未在市售的調(diào)制乳粉中添加。

3 結(jié)論

本文對(duì)維生素K1和維生素K2的色譜條件和前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化,建立了柱后還原-高效液相色譜同時(shí)測定調(diào)制乳粉中維生素K1和維生素K2的分析方法。本方法定性定量準(zhǔn)確,靈敏度高,重復(fù)性好,能滿足調(diào)制乳粉中維生素K含量的檢測要求,可以對(duì)維生素K1和維生素K2的質(zhì)量控制和市場監(jiān)管提供技術(shù)支持,有利于提高嬰幼兒調(diào)制乳粉的安全性。