加速溶劑萃取-QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定藥食同源性食品中16種真菌毒素

方 真, 曲 栗, 古淑青*, 陳柔含, 李 優(yōu), 鄧曉軍, 郭德華, 馮 峰

(1. 上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 上海 200135; 2. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品工程系, 上海 200436; 3. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院, 北京 100176)

真菌毒素是一種由產(chǎn)毒絲狀真菌在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生的具有毒性作用的次級代謝產(chǎn)物[1],易污染農(nóng)產(chǎn)品、食品和中藥材等植物源性產(chǎn)品。目前已知的真菌毒素超過300多種,其中大約有30種易對人體健康產(chǎn)生嚴重威脅,包括黃曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素A(OTA)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)等,過量攝入受污染的食品會導(dǎo)致肝腎功能損壞、致癌、致畸,或誘發(fā)免疫抑制性疾病[2,3]。隨著真菌毒素風險評估工作的不斷深入,許多地區(qū)和國家都對真菌毒素的含量進行了強制性規(guī)定。我國GB 2761-2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》中對上述多種真菌毒素最為嚴格的限量為5 μg/kg,而歐盟等國家則為2 μg/kg。

目前食品中真菌毒素的檢測方法主要有以酶聯(lián)免疫吸附測定法[4]和薄層色譜法[5]為主的定性和半定量檢測方法,以及以毛細管電泳法[6]、液相色譜法[7]為主的定量分析檢測方法。這些傳統(tǒng)檢測方法操作簡單,成本低廉,但定性干擾大,定量靈敏度不足,且只能一次實現(xiàn)一種或一類真菌毒素的定性和定量分析,無法滿足實際樣品中多種痕量真菌毒素污染物同時檢測的需求。近年來,隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展,高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)在檢測毒素方面的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)[8]。HPLC-MS/MS結(jié)合了色譜的分離能力與質(zhì)譜的分子確證功能,兼具高靈敏與高特異性的優(yōu)點,是同時檢測多種毒素的理想方法,近年來被廣泛應(yīng)用于不同樣品中真菌毒素的定性、定量分析[8,9]。

在基于HPLC-MS/MS的檢測工作中,樣品前處理是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。真菌毒素檢測的前處理過程通常包括萃取和凈化兩個步驟。加速溶劑萃取(accelerated solvent extraction, ASE)是近年來新興的一種萃取技術(shù),在較高的溫度和壓力下,利用一定配比的有機溶劑對固體樣品進行萃取[10]。ASE不僅能夠提高目標化合物的萃取效率,而且能夠減少萃取溶劑的使用量,縮短萃取時間。QuEChERS凈化方法是近年來最新發(fā)展起來的一種主要用于農(nóng)殘檢測的前處理方法[11],選擇性使用多種混合凈化填料組合可以高效地去除多種雜質(zhì)。QuEChERS具備高效、簡便、綠色等優(yōu)點,近年來廣泛應(yīng)用于各檢測領(lǐng)域,也包括真菌毒素的分析[12-14]。將ASE和QuEChERS聯(lián)合使用,既能夠提高目標化合物的萃取效率,又滿足了前處理操作簡便、快速的要求[15]。但是,目前還未見結(jié)合兩種技術(shù)應(yīng)用于藥食同源產(chǎn)品中多種真菌毒素檢測的報道。

本實驗采用加速溶劑萃取結(jié)合QuEChERS方法對藥食同源樣品中16種真菌毒素進行萃取和凈化,采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行測定。該方法操作簡單,重復(fù)性好,靈敏度高,可用于藥食同源產(chǎn)品中多種真菌毒素的快速篩查和定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Nexera X2液相色譜儀(日本Shimadzu公司); QTrap 6500三重四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜系統(tǒng)(美國AB Sciex公司); Allegra X-22R離心機(美國Beckman Coulter公司); ASE 350加速溶劑萃取儀(美國Thermo Fisher公司); R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司); N-EVAPTM112氮吹儀(美國Organomation Associates公司)。所有實驗室用水均由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制得。

16種真菌毒素標準品:DON(CAS號:51481-10-8,純度≥99.0% )、玉米赤霉烯酮(ZEN, CAS號:17924-92-4,純度≥99.9% )、3-乙?；撗跹└牭毒┐?3-AcDON, CAS號:50722-38-8,純度≥99.0% )、15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-AcDON, CAS號:88337-96-6,純度≥99.0% )、黃曲霉毒素B1(AFB1, CAS號:1162-65-8,純度≥99.0% )、黃曲霉毒素B2(AFB2, CAS號:7220-81-7,純度≥99.9% )、黃曲霉毒素G1(AFG1, CAS號:1165-65-8,純度≥99.0% )、黃曲霉毒素G2(AFG2, CAS號:7241-98-7,純度≥98.3% )、伏馬毒素B1(FB1, CAS號:116355-83-0,純度≥99.7% )、伏馬毒素B2(FB2, CAS號:116355-84-1,純度≥99.9% )、OTA(CAS號:303-47-9,純度≥99.9% )、赭曲霉毒素B(OTB, CAS號:4825-86-9,純度≥99.0% )、疣孢青霉原(VER, CAS號:12771-72-1,純度≥98.0% )、雜色曲霉毒素(SMC, CAS號:10048-13-2,純度≥99.9% )、T-2毒素(T-2, CAS號:21259-20-1,純度≥98.2% )、HT-2毒素(HT-2, CAS號:26934-87-2,純度≥99.0% )、黃曲霉毒素B1內(nèi)標(U-[13C17]-AFB1, CAS號:1217449-45-0, 0.5 mg/L)、伏馬毒素B1內(nèi)標(U-[13C34]-FB1, CAS號:1217458-62-2, 25 mg/L)均購自美國Sigma公司;胺丙基鍵合硅膠(-NH2)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18均購自上海安譜實驗科技股份有限公司;甲酸(色譜純,美國Fluka公司);乙酸(分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司);乙腈、甲醇(色譜純,美國Thermo Fisher公司)。山銀花、葛根、沙棘樣品均為市售。

1.2 混合標準溶液配制

混合標準儲備液:分別準確稱取適量各標準品,用乙腈-甲醇(3∶2, v/v)配制成含各真菌毒素100 mg/L 的混合標準儲備液,于-20 ℃下避光保存。

內(nèi)標工作液:用乙腈將U-[13C17]-AFB1配制成質(zhì)量濃度為100 μg/L 的同位素內(nèi)標工作液,U-[13C34]-FB1配制成質(zhì)量濃度為250 μg/L 的同位素內(nèi)標工作液,于-20 ℃下避光保存。

基質(zhì)混合標準工作溶液:用空白樣品萃取液將混合標準儲備液配制成適當濃度的基質(zhì)混合標準工作溶液,并加入同位素內(nèi)標溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1 萃取

準確稱取粉碎過篩后的樣品5.00 g,加入黃曲霉素B1同位素內(nèi)標工作液和伏馬毒素B1同位素內(nèi)標工作液各400 μL,然后加入1 g氯化鈉,并與適量硅藻土混勻后,移入34 mL不銹鋼樣品萃取池中進行加速溶劑萃取。萃取試劑為乙腈-水-乙酸(85∶12∶3, v/v/v),萃取溫度75 ℃,加熱時間5 min,靜態(tài)萃取時間5 min,循環(huán)2次,沖洗體積為60%萃取池體積,萃取后氮氣吹掃100 s,收集萃取液于60 mL收集瓶中。最后將萃取液轉(zhuǎn)移至雞心瓶中,于45 ℃水浴中減壓濃縮至近干,加入20 mL乙腈-水(85∶15, v/v)充分溶解殘渣,待凈化。

1.3.2 凈化

取上述待溶液5 mL于離心管中,加入0.6 g -NH2、0.4 g PSA、0.25 g C18,渦旋振蕩5 min。以 10 000 r/min 離心5 min,吸取1 mL上清液于室溫氮吹至近干,加入1 mL含0.1%(v/v)甲酸的乙腈-水(3∶97, v/v)復(fù)溶,過0.22 μm微孔濾膜,待上機。

1.4 分析條件

反相色譜柱:Kinetex XB-C18柱 (100 mm×3 mm, 2.6 μm,美國Phenomenex公司);柱溫:40 ℃;流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液(含5 mmol/L 乙酸銨), B為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫條件:0～0.5 min, 3%B; 0.5～1.0 min, 3%B～10%B; 1.0～6.0 min, 10%B～90%B; 6.0～7.5 min, 90%B; 7.5～7.6 min, 90%B～3%B; 7.6～9.0 min, 3%B。進樣體積:10 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI)源,采用正、負離子同時掃描模式;噴嘴電壓:5 500 V(+)/-4 500 V(-);毛細管溫度:600 ℃;氣簾氣壓力0.207 MPa;碰撞氣電壓強度:medium。16種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件優(yōu)化

2.1.1 ASE條件優(yōu)化

16種真菌毒素的理化性質(zhì)差異較大,因此選擇一種兼容性好、萃取效率高的萃取溶劑尤為重要。本實驗在現(xiàn)有文獻[16-18]報道的基礎(chǔ)上,分別用乙腈、乙腈-乙酸體系和乙腈-水-乙酸體系作為萃取溶劑對空白山銀花樣品進行加標試驗(見圖1)。在pH值相同的情況下,當萃取試劑中含有適量水時,大部分真菌毒素的萃取效率相比使用純乙腈時均有提高,這是因為水能夠增強乙腈的滲透能力,以便于萃取液滲透到基質(zhì)較為復(fù)雜的藥食同源性食品中,從而提高目標物的萃取效率。此外,pH值對于部分酸敏感真菌毒素的萃取效率有較大影響,如DON、ZEN、OTA、FB1、FB2具有羧基基團,水溶性強,對有機萃取溶劑的酸度有一定要求,因此降低萃取液的pH值能提高其穩(wěn)定性,增加萃取效率。實驗進一步對比了當萃取液中含0% 、1% 、3% 和5%體積分數(shù)的乙酸時的萃取效率。從圖1可以看出,隨著乙酸體積分數(shù)的增加,部分真菌毒素的萃取效率有所增加,而當萃取液中含有3%的乙酸時各目標化合物的萃取效率相對較好。因此,實驗選擇乙腈-水-乙酸(85∶12∶3, v/v/v)作為萃取試劑。

表 1 16種真菌毒素及兩種同位素內(nèi)標的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the 16 mycotoxins and two isotopic internal standards

CE: collision energy; DP: declustering potential; * quantitative ion.

圖 1 萃取液對加標山銀花樣品中16種真菌毒素萃取效率的影響Fig. 1 Effect of extraction solvents on the extraction efficiencies of the 16 mycotoxins spiked in the flos lonicerae samples

萃取溫度考察了55、75、85和95 ℃ 4個溫度點。溫度增加可以降低萃取溶劑的黏度,從而提高溶劑對基質(zhì)的浸潤能力和對目標物的溶解能力。但是溫度過高也可能導(dǎo)致目標物產(chǎn)生不可預(yù)知的變化，從而影響最終的萃取效果。結(jié)果表明,當萃取溫度為85 ℃和95 ℃時,各類毒素的回收率都有所減少。綜合考率,本實驗選擇75 ℃作為萃取溫度。

在循環(huán)次數(shù)上,循環(huán)2次與循環(huán)3次,結(jié)果沒有明顯的差異,為了減少樣品前處理的時間,選擇循環(huán)2次。

整個萃取過程大約用時20 min,得到的萃取液較為清澈,無需過濾直接進行蒸發(fā)濃縮。

2.1.2 凈化填料的優(yōu)化

藥食同源性食品基質(zhì)較為復(fù)雜,且實驗采用高溫高壓萃取方式,在萃取目標物化合物的同時也會萃取樣品中其他干擾物,如蛋白質(zhì)、色素、脂質(zhì)和糖類等,因此凈化步驟對于結(jié)果的準確性至關(guān)重要。凈化劑可以通過極性相互作用或非極性相互作用使目標化合物和雜質(zhì)相互分離。本研究考察的凈化劑主要有C18、PSA、石墨化炭黑(GCB)、-NH2、氰丙基鍵合硅膠(-CN)、弗洛里硅土(Florisil)。在空白山銀花基質(zhì)中進行添加回收試驗,各分析物的添加水平為10 μg/kg。分別考察了采用6種凈化劑單獨處理以及不同配比的凈化劑組合處理的凈化效果,比較各真菌毒素的回收率。結(jié)果表明,使用GCB時,黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮回收率較低。因為GCB對具有平面分子結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)具有顯著的吸附作用[19],但目標化合物中黃曲霉毒素等毒素具有平面結(jié)構(gòu)或不完全平面分子結(jié)構(gòu),因此GCB不適于本研究。含有氰丙基鍵合硅膠和胺丙基鍵合硅膠等活性基團的凈化劑可通過氫鍵作用吸附極性物質(zhì)(脂肪酸和有機酸等),實驗中發(fā)現(xiàn)-NH2能強烈吸附基質(zhì)中的極性色素,凈化非極性毒素。C18能夠吸附基質(zhì)中非極性物質(zhì),有效去除糖類,但凈化能力有限,加入PSA和-NH2后,各類真菌毒素的回收率都得到了提高,這與糖類、有機酸、脂肪酸等主要干擾物質(zhì)被去除后降低了基質(zhì)效應(yīng)的影響有關(guān)[20]。因此,本實驗最終采用C18、PSA和-NH2協(xié)同凈化的方式,增強雜質(zhì)的凈化能力,降低離子抑制作用,提高方法的準確度。

2.2 超高效液相色譜條件優(yōu)化

實驗考察了2種色譜柱(Waters, ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)和Phenomenex, Kinetex XB-C18 (100 mm×3 mm, 2.6 μm))對16種真菌毒素分離效果的影響。結(jié)果表明:使用T3柱時,3-AcDON和15-AcDON這對同分異構(gòu)體無法達到基線分離,且峰形較差,響應(yīng)較低。而使用Phenomenex Kinetex XB-C18柱則能達到較好的分離效果。該柱內(nèi)徑和填料粒徑均較小,能夠獲得良好的分離度。

由于真菌毒素易溶于甲醇或乙腈,實驗還分別考察了甲醇和乙腈作為強洗脫流動相的洗脫效果。當乙腈-水體系作為流動相時,在正、負兩種模式下的洗脫效果和響應(yīng)強度均好于甲醇-水體系,這有可能是因為少數(shù)待測物中含有乙酰氧基團,而此類化合物在甲醇中不穩(wěn)定。因此,實驗選擇乙腈作為強洗脫流動相。在流動相中加入0.1%(v/v)的甲酸可以提高待測物在電噴霧電離、正離子模式中的離子化效率,提高靈敏度。當使用0.1%(v/v)甲酸水和0.1%(v/v)甲酸乙腈進行梯度洗脫時,AFG2存在嚴重的拖尾現(xiàn)象,而在水相中加入少量的乙酸銨能消除這種現(xiàn)象。為了增大目標化合物的響應(yīng)值并且改善峰形,實驗進一步考察了不同濃度的乙酸銨對目標化合物離子化效率的影響。結(jié)果表明,在水相中加入5 mmol/L 乙酸銨能夠最大限度增加目標化合物的響應(yīng)值并改善峰形,而過高濃度的乙酸銨反而會降低目標化合物的離子化效率。所以實驗最終選擇含5 mmol/L 乙酸銨的0.1%(v/v)甲酸水溶液和0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液作為流動相。由于藥食同源性食品基質(zhì)較為復(fù)雜且分析物較多,實驗選擇梯度洗脫進行分析以達到縮短出峰時間和高效除去色譜柱中殘留雜質(zhì)的目的。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在優(yōu)化質(zhì)譜采集參數(shù)時,同時考察了16種真菌毒素在正、負離子模式下的響應(yīng)值,發(fā)現(xiàn)除了ZEN在負模式下響應(yīng)較好,其余的15種目標物均在正離子模式下響應(yīng)較好。除了T-2的母離子為[M+NH4]+峰,其余15種化合物在選定的分析條件下都產(chǎn)生[M+H]+峰。在MRM分析中選擇了離子豐度最高的子離子作為定量離子,離子豐度次高的作為定性離子,并且優(yōu)化了CE值和DP值,以獲得較高的響應(yīng)值。各化合物的提取離子流色譜圖見圖2。

圖 2 16種真菌毒素標準品及同位素內(nèi)標的提取離子流色譜圖Fig. 2 Extracted ion current chromatograms of the 16 mycotoxins and the isotope internal standards

2.4 方法學(xué)驗證

2.4.1 標準曲線、線性范圍及檢出限

由于AFB1和FB1的穩(wěn)定同位素內(nèi)標試劑易獲得,實驗中AFB1和FB1用內(nèi)標法定量,其余毒素用外標法定量。

在空白山銀花樣品基質(zhì)中添加目標化合物,分別加入100 μL AFB1和FB1的同位素內(nèi)標工作液,配制成系列濃度的標準工作溶液。AFB1和FB1以其與同位素內(nèi)標響應(yīng)峰面積之比為縱坐標(Y′),其余14種化合物以峰面積(Y)為縱坐標,分別以對應(yīng)的質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標,繪制標準曲線。以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。

如表2所示,16種真菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)線性良好,線性相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。16種真菌毒素的檢出限為0.008～0.3 μg/kg,定量限為0.03～1.0 μg/kg,遠低于國家標準對真菌毒素限量檢測要求和歐盟、日本等國家規(guī)定的最大殘留量。

表 2 16種真菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the 16 mycotoxins

Y: peak area;Y′: peak area ratio of the analyte to isotope internal standard;X: mass concentration, μg/L.

2.4.2 加標回收率和精密度

分別用山銀花、葛根、沙棘空白樣品作為基質(zhì),添加3個不同水平的待測物,平行測定6次,計算回收率以及相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表3?？梢钥闯?16種真菌毒素的平均回收率為70.8% ～118% ,使用內(nèi)標校準后,AFB1和FB1的回收率更高，可達90%以上；RSD為2.5% ～10.2% ,滿足檢測要求。

表 3 16種真菌毒素在3種基質(zhì)中的回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviation (RSDs) of the 16 mycotoxins spiked in three matrices (n=6)

表 3 (續(xù))Table 3 (Continued)

2.5 實際樣品檢測

采用建立的方法分別對電商銷售的30個批次的山銀花、葛根和沙棘進行16種真菌毒素的殘留量測定。

結(jié)果表明，1個批次的沙棘樣品和1個批次的葛根樣品被檢出含有AFB1,污染水平分別為3.59 μg/kg 和6.17 μg/kg。1個批次的沙棘樣品被檢出含有AFG2,污染水平高達11.7 μg/kg。1個批次的山銀花樣品被檢出含有OTA,污染水平為7.45 μg/kg。2個批次的沙棘樣品和1個批次的葛根樣品被檢出含有FB1,污染水平為52.6～96.9 μg/kg。其余真菌毒素均未檢出。

3 結(jié)論

本文建立了一種基于ASE和QuEChERS聯(lián)用的前處理技術(shù),結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測藥食同源性食品中16種真菌毒素的檢測方法。與傳統(tǒng)方法相比,本方法減少了有機溶劑用量,縮短了檢測周期,提高了檢測靈敏度,檢出限、定量限遠低于國家標準對真菌毒素限量檢測要求和歐盟、日本等國家規(guī)定的最大殘留量。方法學(xué)考察及實際樣品檢測證明,該方法具有實用性強、靈敏度高、操作簡便快速等優(yōu)點,能夠滿足國內(nèi)外對植物源性藥食同源產(chǎn)品中多種真菌毒素的檢測要求。