成年人鼻中隔軟骨的成分分析

徐海艇，胡科鵬，薛繼鑫，史吏，宋永煥，李曉陽

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院整形外科，浙江溫州325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟學(xué)院，浙江溫州325035）

鼻整形通常需要結(jié)構(gòu)材料來修復(fù)因外傷、先天性畸形或先前手術(shù)切除而造成的軟骨缺損[1]，自體的、異體的、合成的植入物和移植物都有較廣泛的應(yīng)用。然而，異體材料具有免疫排斥、疾病傳播和再吸收的風險，而合成材料與感染、擠壓和異物反應(yīng)的風險相關(guān)[2]。因此自體軟骨往往是首選的材料，供區(qū)多來自鼻中隔軟骨，耳甲腔和肋軟骨區(qū)。在這些材料中，自體鼻中隔軟骨因其良好的力學(xué)性能、容易獲取、供體部位發(fā)病率低而成為鼻部重建的首選材料[3]。然而，自體鼻中隔軟骨的應(yīng)用受到多種限制，如可用組織數(shù)量有限、部分缺損重建幾何結(jié)構(gòu)不佳。這些限制促使研究人員探索尋找軟骨自體移植物的替代重建材料。組織工程所需的自體鼻中隔軟骨形狀和數(shù)量可以通過擴增培養(yǎng)軟骨細胞制作出來[4]，然后在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中進行分化以產(chǎn)生功能軟骨細胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）[5]。成熟和塑形階段可產(chǎn)生與預(yù)期的形狀和結(jié)構(gòu)特性相一致的新生軟骨[6]。然而重建鼻中隔軟骨，必須要明確鼻中隔軟骨各部位的成分。本研究將鼻中隔軟骨分為5個區(qū)域以更好地理解鼻中隔軟骨成分與不同區(qū)域的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 7具匿名新鮮冷凍尸體的鼻中隔軟骨，2015年2月至2018年2月（解剖教研室提供）均無明顯的鼻中隔軟骨偏曲。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 方法 用鼻翼緣閉合切口或開放切口的方法，逐層暴露7位成年人尸體鼻部解剖層次，然后完整切取鼻中隔軟骨，清除表面軟組織，并將鼻中隔軟骨分為5個區(qū)域，分別標記為a，b，c，d，e區(qū)（見圖1）。

圖1 鼻中隔軟骨5個區(qū)域分布

1.3 生化檢測 生物化學(xué)測定用的樣品在磷酸鹽緩沖的乙二胺四乙酸（0.5mg/mL）中用蛋白酶K（proteinaseK，PK）使其消化溶解一夜，溫度為55℃。采用適用于人軟骨的PicoGreenDNA含量測定法（美國Invitrogen公司）測定細胞數(shù)量。取每個樣品消化液的一部分與PicoGreen試劑混合。在熒光分析儀上用480nm激發(fā)光波長和520nm發(fā)射波長測定熒光。在適當?shù)木彌_溶液中，用人類DNA度量標準將熒光值轉(zhuǎn)換為DNA量。再將DNA含量標準化，以確定細胞數(shù)（7.8pgDNA/軟骨細胞）和每mg濕組織質(zhì)量。

采用PK消化液和二甲基亞甲基藍（dimethylmethyleneblue，DMMB）反應(yīng)測定硫酸糖胺聚糖（sulfatedglycosaminoglycans，sGAG）的含量。每個樣本取消化液的一部分與DMMB染料混合。用熒光分析測得525nm處的吸光率，并與用C型硫酸軟骨素制成的標準品（美國Sigma公司）進行比較。人軟骨中存在的sGAG主要是硫酸軟骨素，透明質(zhì)酸和角蛋白硫酸酯所占比例較小[7]。因此，使用硫酸軟骨素作為標準來源進行比較是合理的。此外，用該方法測定sGAG與人軟骨的固定電荷密度高度相關(guān)。sGAG含量用每mg濕組織質(zhì)量（消化前）和DNA含量進行標化。

采用羥脯氨酸法測定PK消化液中總膠原蛋白的含量[7]。在通風柜中，加入與樣品體積相等的12.1mol/L鹽酸（美國Sigma公司），在110℃下孵育16～18h。樣品從高溫中取出，讓其恢復(fù)到室溫，短暫離心，在110℃（16～24h）條件下蒸發(fā)干燥。干燥后的樣品溶解在枸櫞酸鹽緩沖液中。將部分重組樣品和羥脯氨酸標準品與氯胺T試劑反應(yīng)，然后再與對二氨基苯甲醛反應(yīng)，用EMAX精密微孔板讀數(shù)儀（美國Sunnyvale公司）在560nm處讀取吸光率。以羥脯氨酸衡量標準為基礎(chǔ)，將樣品吸光率轉(zhuǎn)換為羥脯氨酸含量。羥脯氨酸含量按每mg濕組織質(zhì)量（消化前）和DNA含量進行標化。根據(jù)膠原蛋白與羥脯氨酸的質(zhì)量比值（為7.1），將羥脯氨酸含量轉(zhuǎn)化為膠原蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey-HSD法檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 每mg濕重細胞數(shù)和膠原蛋白量 濕軟骨片段5個區(qū)域每mg濕重細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），每mg濕重的膠原蛋白含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 每mg濕重所含sGAG量 每mg濕重的sGAG含量各區(qū)域間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）；與a區(qū)和c區(qū)比，b區(qū)和d區(qū)的sGAG含量顯著增加（P＜0.05），可知sGAG在鼻中隔軟骨并非均勻地分布于各個區(qū)域，見表1。

2.3 膠原蛋白與sGAG的比值 膠原蛋白與sGAG的比值在各區(qū)域間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與a區(qū)和c區(qū)比，b區(qū)、d區(qū)和e區(qū)膠原蛋白與sGAG的比值顯著減?。≒＜0.05），見表1。

表1 鼻中隔軟骨成分5個區(qū)域的變化（每組n=7，

表1 鼻中隔軟骨成分5個區(qū)域的變化（每組n=7，

與a區(qū)比：aP ＜0.05；與c區(qū)比：bP ＜0.05

區(qū)域 每mg濕重細胞數(shù)（×103） 每mg濕重所含膠原蛋白（μg） 每mg濕重所含sGAG（μg） 膠原蛋白與sGAG的比值總量 22.9±2.9 60.3±6.4 14.6±3.5 4.14±0.8 a 23.0±2.9 60.9±6.2 13.1±1.6 4.61±0.4 b 24.1±2.5 62.5±5.9 16.5±1.3ab 3.70±0.3ab c 21.7±3.1 59.0±7.2 12.7±0.9 4.65±0.4 d 22.5±3.1 61.4±7.1 16.3±1.1ab 3.81±0.8ab e 23.4±2.6 57.7±4.7 14.5±2.4 3.92±0.2ab F 0.715 0.654 9.336 6.609 P 0.588 0.629 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

成人軟骨含有軟骨細胞和大量的ECM，按重量計算膠原蛋白是最豐富的分子成分。已經(jīng)證明ECM中的膠原纖維可以加強軟骨組織的完整性、抗拉剛度、抗拉強度和抗脹性。蛋白聚糖是軟骨的另一主要分子成分，主要以聚集蛋白聚糖的形式存在。高分子聚合蛋白由一個附著許多sGAG鏈的核心蛋白質(zhì)組成[8]。雖然關(guān)節(jié)軟骨的組成已被充分記錄，但以前的研究沒有量化人鼻中隔軟骨主要成分（軟骨細胞、膠原蛋白和硫酸化糖胺聚糖）的相對濕重。為了提供用于重建新的人鼻中隔軟骨基線數(shù)據(jù)，本研究使用7個成人鼻中隔軟骨標本建立這樣的信息。

NEUMAN等[9]從鼻中隔軟骨（剛好在上頜嵴之上）獲取軟骨，測定了人鼻中隔軟骨的細胞結(jié)構(gòu)和主要基質(zhì)成分，其研究結(jié)果顯示，每mg軟骨濕重含24900個細胞（3700～51800），77.4μg膠原蛋白（458～128.6μg），28.7μgsGAG（13.6～44.6μg），膠原蛋白與sGAG的平均比值為3.03。這與本研究中所得的數(shù)值相當。許多組織的軟骨成分因其特定位置而異，如關(guān)節(jié)軟骨組成取決于關(guān)節(jié)的位置、關(guān)節(jié)的區(qū)域和關(guān)節(jié)表面的深度。已報道的人類關(guān)節(jié)軟骨細胞數(shù)量比本研究中鼻中隔軟骨的測量值低兩倍左右[10]，而文獻中測定的人股骨髁中的膠原蛋白和sGAG則比鼻中隔軟骨ECM中的值高。雖然關(guān)節(jié)軟骨和鼻中隔軟骨都歸為透明軟骨，但它們有不同的胚胎起源和內(nèi)在固有的功能，這可能解釋了它們在組成上的一些差異[11]。本研究發(fā)現(xiàn)鼻中隔軟骨主要成分中軟骨細胞數(shù)和膠原蛋白含量在不同區(qū)域沒有明顯的變化。鼻中隔軟骨sGAG含量在不同區(qū)域有明顯的變化，膠原蛋白與sGAG的比值也有明顯的差異。此外，sGAG沉積的局部形態(tài)與鼻整形或鼻重建術(shù)中著重保留的L型支柱形狀相一致。

軟骨細胞ECM中某些結(jié)構(gòu)分子的相對量影響軟骨的機械剛度、強度和穩(wěn)定性。在人類關(guān)節(jié)軟骨中，糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）分子賦予組織固定的負電荷，增加組織膨脹和抗壓負荷的能力，而拉伸強度主要歸因于膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)的作用[12]。軟骨中的sGAG（GAG的一種）側(cè)鏈負責其凈負電荷，吸引正離子和水進入ECM。關(guān)節(jié)軟骨中，膠原蛋白的含量是GAG含量的2～10倍，其含量取決于取樣組織的區(qū)域和組織承受的機械載荷[13]。機械強度和硬度與膠原蛋白與GAG的比值增加密切相關(guān)。在本研究中，人鼻中隔軟骨中膠原蛋白的平均含量約為sGAG含量的4.14倍，鼻中隔軟骨b、d區(qū)域sGAG含量明顯高于a、c區(qū)?；谏鲜鰧﹃P(guān)節(jié)軟骨的研究，預(yù)測代表鼻中隔軟骨腹側(cè)的b、d區(qū)域也將具有更大的抗壓能力和韌性，這一特性與該區(qū)域的解剖基礎(chǔ)有關(guān)，即位于鼻中隔軟骨的基底部。

在鼻整形術(shù)和鼻部重建手術(shù)相關(guān)研究中，重點強調(diào)了鼻中隔軟骨的背側(cè)和尾側(cè)的L型支柱是支撐和維持鼻部穩(wěn)定的關(guān)鍵區(qū)域之一，還為鼻部提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用[14-15]。這一區(qū)域的畸形或缺陷可造成美學(xué)和功能問題，如馬鞍鼻畸形、鼻尖位置不正、扭曲鼻；因此，本研究中報道的鼻中隔軟骨a、c區(qū)膠原蛋白與sGAG比值較高支持了這一假設(shè)，即該區(qū)域鼻中隔軟骨有更大的機械強度和硬度，科學(xué)地證實了L型支柱保留的價值。

組織工程重建的人鼻中隔軟骨組織若要適應(yīng)人類體內(nèi)環(huán)境，必須持久適應(yīng)體內(nèi)環(huán)境的力學(xué)需求，在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、生化和生物力學(xué)特性上都要與原生組織相似。本研究提供了人類鼻中隔軟骨組成成分的量化圖，組織工程化鼻中隔軟骨很有可能在未來頭頸部重建外科學(xué)上發(fā)揮作用。

綜上所述，深入了解人鼻中隔軟骨的天然成分，將作為設(shè)計符合特定重建目標的工程新技術(shù)的基礎(chǔ)。未來的實驗工作將包括繪制整個人類鼻中隔軟骨的力學(xué)特性。