mTOR 在不同毛色綿羊皮膚的表達(dá)與定位

渠國(guó)文，孫笑尉，龐全海

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山西太谷 030801）

哺乳動(dòng)物毛色形成是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)，其形成的每一個(gè)水平都有各個(gè)調(diào)節(jié)因子互相作用來(lái)調(diào)控。其中研究最多的具有重要調(diào)控黑色素形成作用的基因?yàn)樾⊙刍蜗嚓P(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MIcrophthalmia-associated Transcription Factor，MITF），其作為黑色素合成主要信號(hào)通路下游關(guān)鍵因子，在色素細(xì)胞發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵性作用[1]。MITF 蛋白激活和調(diào)節(jié)3 種色素沉著酶基因，即酪氨酸酶（Tyr）、酪氨酸酶相關(guān)蛋白1（Tyrp1）和多巴色素-互變異構(gòu)酶（Dct/ Tyrp-2）[2-3]，促進(jìn)真黑色素合成；MITF 蛋白含量降低時(shí)，可使黑色素細(xì)胞內(nèi)合成的Tyr 活性下降，產(chǎn)生褐黑色素[4]。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of Rapamycin,mTOR）屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是哺乳動(dòng)物信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組成部分，調(diào)節(jié)生物體的生長(zhǎng)、繁殖和哺乳動(dòng)物的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[5]。mTOR 通路是自噬領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，且近年來(lái)有研究表明自噬可調(diào)控黑色素細(xì)胞生成[6-8]。推測(cè)mTOR 可能在哺乳動(dòng)物毛色形成方面具有調(diào)控作用。因此，探討mTOR 在不同毛色綿羊皮膚的表達(dá)與定位對(duì)深入了解mTOR 的生物學(xué)功能具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)以白色、棕色和黑色綿羊皮膚為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用qPCR 法檢測(cè)mTOR基因的相對(duì)表達(dá)量，Western blotting 技術(shù)檢測(cè)p-mTOR 蛋白的相對(duì)表達(dá)量，免疫組化技術(shù)對(duì)p-mTOR 進(jìn)行定位，為進(jìn)一步研究mTOR 在調(diào)控動(dòng)物毛色中的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其組織 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)綿羊養(yǎng)殖基地隨機(jī)選取健康性成熟的白色、棕色和黑色哈薩克綿羊各3只，取背部皮膚組織各3 塊。其中2 塊放入液氮中用于提取RNA 和蛋白，1 塊直接放入4% 的組織細(xì)胞固定液中室溫固定48 h 后于70%的無(wú)水乙醇中存放。

1.2 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）和TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）購(gòu)自TaKaRa 公司；Anti-Phospho-MTORS2448 多克隆抗體、組織細(xì)胞裂解液、DAB 試劑盒染料、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL Plus 超敏發(fā)光液、中性樹(shù)膠和4% 組織細(xì)胞固定液購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；抗兔/鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒、rabbit anti-β-actin 多克隆抗體和goat anti-rabbit IgG 購(gòu)自北京三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA 提取及cDNA 的合成 使用RNAiso Plus試劑提取保存于液氮中白色、棕色和黑色綿羊皮膚組織的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-20℃冰箱中保存。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank 上已登錄的綿羊的mTOR和β-actinmRNA 序列，利用Primer Premier 6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR 擴(kuò)增引物，引物由華大基因（深圳）合成，引物序列如表1。

表1 引物序列及PCR 擴(kuò)增條件

1.3.3 qRT-PCR 根據(jù)TB GreenTMPremix EX TagTMII 試劑盒建議反應(yīng)條件構(gòu)建反應(yīng)體系，每個(gè)樣本重復(fù)3 次，使用不添加模板的空白作陰性對(duì)照。反應(yīng)體系25 μL：TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）12.5 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 模板2.0 μL和ddH2O8.5 μL。擴(kuò)增條件：95℃變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s 共40 個(gè)循環(huán)，軟件自動(dòng)得出擴(kuò)增曲線、熔解曲線和循環(huán)閾值，分析所得結(jié)果。根據(jù)熒光曲線CT 值采用2-ΔΔCT計(jì)算定量結(jié)果。

1.3.4 Western boltting 分析 利用組織細(xì)胞蛋白提取試劑盒提取皮膚樣品的總蛋白，使用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)其蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交、曝光得到蛋白印跡，使用Image-Pro Plus 6.0 蛋白分析軟件，分析mTOR 和β-actin 的印跡結(jié)果。Anti-Phospho-MTOR-S2448 抗體稀釋比例為1:300，rabbit anti-β-actin 抗體稀釋比例為1:2 000，Goat Anti-Rabbit IgG 稀釋比例為1:3 000。

1.3.5 免疫組化檢測(cè) 將置于樣品組織，經(jīng)梯度酒精（70%、75%、80%、85%、90%、95%和100%）脫水并使用二甲苯透明后進(jìn)行包埋并制作切片。二甲苯和梯度酒精(100%、95%、90%、85%、80%、75%和70%)脫蠟，使用免疫組化試劑盒對(duì)烘干的組織切片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，Anti-Phospho-MTOR-S2448 抗體稀釋比例為1:100，陰性對(duì)照組使用PBS 代替一抗。DAB 顯色液顯色，在顯微鏡下觀察顏色變化，蘇木素復(fù)染、分化、透明后中性樹(shù)膠封片。使用ECLIPSE Ti-U 生物倒置顯微鏡對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 使用GraphPadPrism 6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1mTOR在綿羊不同毛色皮膚組織中mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 qRT-PCR 結(jié)果如圖1 所示，mTORmRNA 在棕色和黑色綿羊皮膚中表達(dá)量為白色綿羊皮膚中的6.7（P＜0.01）和23.8 倍（P＜0.001）；黑色綿羊皮膚中表達(dá)量為棕色綿羊皮膚中的3.6 倍（P＜0.01）。

2.2 不同毛色綿羊皮膚組織中p-mTOR 蛋白的表達(dá)量分析 Western blotting 檢測(cè)結(jié)果如圖2-A 所示，在綿羊不同毛色皮膚中見(jiàn)分子量大小約為289 ku 的蛋白；β-actin 作為內(nèi)參，其分子量約為42 ku。如圖2-B 所示，p-mTOR 蛋白在白色綿羊皮膚中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于棕色和黑色綿羊皮膚中的相對(duì)表達(dá)量；黑色皮膚的表達(dá)量顯著高于棕色皮膚。

2.3 不同毛色綿羊皮膚組織中p-mTOR 蛋白的表達(dá)與定位 通過(guò)免疫組織化學(xué)法對(duì)p-mTOR 蛋白在不同毛色綿羊皮膚組織中的表達(dá)進(jìn)行定位，結(jié)果如圖3 所示，p-mTOR 蛋白在皮膚組織的表皮、毛基質(zhì)、毛乳頭、根鞘部及毛干呈陽(yáng)性表達(dá)，陰性對(duì)照組中未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。

3 討 論

自噬通過(guò)磷酯酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/ AKT/ mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)參與人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中異黃體生成素誘導(dǎo)的黑色素降解[9]。Yu-Tzu T 等[10]研究發(fā)現(xiàn)用扁柏酚處理B16F10 細(xì)胞后，扁柏酚以劑量依賴性方式降低MITF 和酪氨酸酶及細(xì)胞黑色素含量。同時(shí)，微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）-II 和beclin 1（自噬標(biāo)記）增加，發(fā)現(xiàn)扁柏酚通過(guò)AKT/ mTOR信號(hào)通路抑制黑素生成[10]。研究表明，mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于毛發(fā)（包括毛色）再生過(guò)程中毛囊干細(xì)胞的激活至關(guān)重要，其激活作用通過(guò)BMP 介導(dǎo)的毛發(fā)再生過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)[11]。本研究表明，mTOR基因在白色綿羊皮膚中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于棕色和黑色綿羊，且黑色皮膚中的表達(dá)量顯著高于棕色皮膚，p-mTOR 蛋白在不同毛色綿羊皮膚中的相對(duì)表達(dá)量與mTOR基因有相同的趨勢(shì)，并與白色、棕色和黑色羊毛中的真黑色素含量趨勢(shì)相同[12]。

毛乳頭是向毛干和表皮提供黑色素的部位也是哺乳動(dòng)物被毛產(chǎn)生色素的唯一場(chǎng)所，其中含有大量有活性的黑色素細(xì)胞，含有大量的黑色素顆粒輸出以供毛發(fā)生長(zhǎng)時(shí)色素的沉積[13-14]。在不同毛色羊駝皮膚成熟黑色素細(xì)胞分布規(guī)律不同，在有色被毛皮膚組織中其主要分布在毛乳頭部，表皮分布較少；在白色被毛皮膚組織中大多分布在表皮而毛乳頭分布較少[15]。黑色素細(xì)胞的前體細(xì)胞即黑色素母細(xì)胞存在于毛根鞘中，成年小鼠黑色素母細(xì)胞在毛發(fā)周期中發(fā)育生成黑色素細(xì)胞。本研究利用免疫組織化學(xué)法對(duì)p-mTOR 蛋白在綿羊皮膚組織的表達(dá)進(jìn)行了定位，p-mTOR 蛋白在皮膚組織的表皮、毛基質(zhì)、毛乳頭、根鞘部及毛干均有表達(dá)。由上可以推測(cè)mTOR參與動(dòng)物毛色形成過(guò)程。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，mTOR基因在棕色和黑色綿羊皮膚中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于白色綿羊皮膚，且在黑色綿羊皮膚中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于棕色綿羊皮膚；p-mTOR 蛋白在白色、棕色和黑色綿羊皮膚中的相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)與mTOR基因相同；p-mTOR 蛋白在綿羊皮膚組織的表皮、毛基質(zhì)、毛乳頭、根鞘部及毛干表達(dá)，提示mTOR 與毛色的形成具有一定的相關(guān)性。