水母黏蛋白（Qniumucin）的研究進(jìn)展

馮金華 劉紅英 賈高旺

摘要 水母黏蛋白Q-mucin（Qniumucin）是從多種水母中分離的一類新的黏蛋白的總稱。與目前所發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)黏蛋白相比，其具有結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單且高度均質(zhì)、糖鏈短、應(yīng)用于人體不容易出現(xiàn)過敏反應(yīng)等特點(diǎn)，未來在材料、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著比較好的開發(fā)和應(yīng)用前景。從Q-mucin的制備和結(jié)構(gòu)特征等方面，總結(jié)了Q-mucin的研究進(jìn)展，以期為水母黏蛋白的進(jìn)一步研究及其他黏蛋白的研究提供參考。

關(guān)鍵詞 水母黏蛋白;重復(fù)序列;結(jié)構(gòu);開發(fā)

Abstract Qmucin is a new kind of mucin isolated from a variety of jellyfish.Compared with most of the mucins found at present，it has the characteristics of simple structure，high homogeneity，short sugar chain and less allergic reaction when applied to human body.In the future，it has good development and application prospects in materials，medicine and other fields.In terms of the preparation and structural characteristics of Qmucin，some research progress of Qmucin were summarized，in order to provide reference for further research of jellyfish mucin and other mucins.

Key words Qmucin;Repetitive sequence;Structure;Development

黏蛋白特指構(gòu)成生物黏液凝膠結(jié)構(gòu)的一類大分子（105～107 kDa）糖蛋白，以高度O-糖基化和含有連續(xù)重復(fù)肽鏈序列為特征。黏蛋白的多肽骨架含有空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定一致的可變數(shù)目的重復(fù)序列，重復(fù)序列通過二硫鍵首尾相連形成，序列的中間區(qū)域含有較多的蘇氨酸和絲氨酸，大量的寡糖側(cè)鏈通過O-糖肽鍵與蘇氨酸和絲氨酸相連，使主鏈的中間區(qū)域具有很好的親水性[1]。通常，糖類占黏蛋白分子總質(zhì)量50%以上。20世紀(jì)80年代以來，已發(fā)現(xiàn)超過20種人類黏蛋白及其他一些動(dòng)物及植物黏蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，不同動(dòng)物黏蛋白之間大的不同點(diǎn)主要在核心肽序列、非黏蛋白區(qū)域序列和糖鏈結(jié)構(gòu)（糖型）。植物黏蛋白如從蓮花、秋葵莢、山藥中提取的黏蛋白，是由短肽鏈連接著長(zhǎng)的糖鏈（如半乳聚糖和甘露聚糖）構(gòu)成，而哺乳動(dòng)物黏蛋白不具有這些寡糖鏈結(jié)構(gòu)。因此將植物黏蛋白應(yīng)用于人體會(huì)引起強(qiáng)抗原反應(yīng)[2]。

目前只有很少種類的動(dòng)物黏蛋白如胃黏蛋白[3]和下頜唾液黏蛋白[4-5]被大量生產(chǎn)。胃黏蛋白產(chǎn)品目前仍是一種混合物，除總糖和氨基酸含量外，其他性質(zhì)還不明確。下頜唾液黏蛋白包括牛、綿羊、豬下頜黏蛋白（BSM、OSM、PSM），具有非常高的均質(zhì)性以及簡(jiǎn)單的主鏈和糖鏈，氨基酸序列和糖鏈結(jié)構(gòu)已被檢測(cè)，其單抗已經(jīng)生產(chǎn)并用作癌癥的標(biāo)志物[6]。從海洋生物如海星[7]、蝸牛[8]、烏賊[9]等中雖提取到黏蛋白，但產(chǎn)品量非常有限?；瘜W(xué)合成和蛋白質(zhì)工程手段生產(chǎn)黏蛋白也遇到了一些問題。由于O-糖基化是細(xì)胞系統(tǒng)中大量的酶和組織（如高爾基體）的相互作用形成的，所以黏蛋白立體化學(xué)特異性的問題比較難通過化學(xué)合成的方法解決。蛋白質(zhì)工程手段生產(chǎn)黏蛋白雖然可行，但從哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)和純化出重組體黏蛋白的研究費(fèi)用比較昂貴。因此，目前從動(dòng)物或植物中提取天然黏蛋白仍是大量商業(yè)化生產(chǎn)黏蛋白的唯一有效途徑[6]。

海洋生物水母是腔腸動(dòng)物的典型代表，在海洋中分布廣泛，而且種類多、數(shù)量大[10]，近些年在很多海域都存在著水母暴發(fā)的現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)，海洋生物水母中廣泛存在一類能夠在溶液中形成凝膠的屬于黏蛋白家族的聚合物，被稱為qniumucin（Q-mucin）?？赡苁怯捎谇荒c動(dòng)物在動(dòng)物演化上是真正后生動(dòng)物起點(diǎn)的原因，與其他已發(fā)現(xiàn)的黏蛋白相比，Q-mucin的結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出一定原始性和獨(dú)特性，雖然目前對(duì)其研究還比較少，但是不論是從其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)考慮還是從其性質(zhì)和功能考慮，Q-mucin都有一定的開發(fā)應(yīng)用前景。另外，Q-mucin在水母中的含量豐富，是一種有著可大量制備潛力的黏蛋白。所以對(duì)Q-mucin的進(jìn)一步研究有一定的研究?jī)r(jià)值和研究意義。該研究對(duì)Q-mucin的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以期為水母黏蛋白的進(jìn)一步研究及其他黏蛋白的研究提供參考。

1 Q-mucin的制備

1.1 Q-mucin的提取及分離

提純生物黏液中黏蛋白的通用方法為CsCl密度梯度離心法，是利用黏液中糖蛋白與蛋白質(zhì)、糖類及核酸的密度的不同而進(jìn)行分離的一種方法，已被用于提取多種黏蛋白[11-13]。

關(guān)于Q-mucin制備的報(bào)道，是以水母整體或者部分組織如生殖腺、傘部或口腕部為原料，不是以水母黏液為原料。大量的Q-mucin在幾乎所檢測(cè)的水母的每個(gè)器官被發(fā)現(xiàn)，推測(cè)它可能是維持生命的黏液的來源。提取分離方法為：將新鮮的或冷凍的水母樣品切成小塊，在低溫（如4 ℃）下，水或者水溶液（如0.2%的NaCl溶液）中浸提，使樣品表面的黏蛋白溶解到溶液中;浸提液經(jīng)乙醇沉淀，沉淀透析，冷凍干燥得Q-mucin粗品;采用陰離子交換色譜或陰離子交換靜態(tài)吸附方法對(duì)粗品進(jìn)行純化，得Q-mucin純品[14-15]。據(jù)報(bào)道，Q-mucin純品的產(chǎn)量可達(dá)1%～4%干重、0.02%～0.10%濕重[14]。目前鮮見水母黏蛋白CsCl密度梯度離心分離的報(bào)道。

采用離子交換色譜法對(duì)Q-mucin粗品進(jìn)行分離時(shí)，同時(shí)檢測(cè)洗脫液在280和215 nm的洗脫曲線，是根據(jù)Q-mucin在280 nm的吸收比較弱、在215 nm的吸收比較強(qiáng)的特點(diǎn)來判斷Q-mucin純品所在洗脫峰的[14]。

1.2 Q-mucin的電泳檢測(cè)

蛋白質(zhì)的定性檢測(cè)主要采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法，但是SDS-PAGE電泳應(yīng)用于黏蛋白檢測(cè)時(shí)受到了阻礙，這主要因?yàn)轲さ鞍椎囊恍┬再|(zhì)如一般分子量較大;在水溶液中更會(huì)發(fā)生締合而呈現(xiàn)生物超分子狀態(tài);且在濃度適當(dāng)時(shí)自身會(huì)形成凝膠，形成一種致密的纏繞的分子網(wǎng)絡(luò)，使其在即使是最有滲透性的介質(zhì)中運(yùn)動(dòng)也變得很難，因而通常情況下在聚丙烯酰胺凝膠中不能明顯的遷移[16]。在SDS-PAGE試驗(yàn)中，哺乳動(dòng)物黏蛋白主要集中在凝膠加樣口附近[16-17]。這是黏蛋白SDS-PAGE電泳的一個(gè)特點(diǎn)。

另外，由于黏蛋白糖鏈占分子量的50%以上，使其一般缺乏明顯的蛋白質(zhì)染色特征，如考馬斯亮藍(lán)染色不明顯，但是糖染色（一般采用PAS染色法）明顯[17]。據(jù)報(bào)道，Q-mucin的SDS-PAGE電泳的考馬斯亮藍(lán)染色或銀染沒有成功，也表明Q-mucin序列中缺乏對(duì)這些方法敏感的部分[6]。

2 Q-mucin的結(jié)構(gòu)特征

2.1 Q-mucin的分子量及主鏈結(jié)構(gòu)

Q-mucin具有一個(gè)廣泛分布的分子量。如越前水母（Nemopilema nomurai）外胚層和口腕中含有分子量分別為40和130 kDa的2種黏蛋白;海月水母（Aurelia aurita）、水曳水母（Chrysaora Melanaster）、海蜇（Rhopilema esculentae）中膠層中分別分離到分子量為150、140和130 kDa的黏蛋白[14]。

Q-mucin具有明確的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，不存在其他額外結(jié)構(gòu)域。從不同種類水母中得到的黏蛋白的主要差別不是肽部分，而是糖部分。串聯(lián)重復(fù)單元N-末端打開，從N末端開始，由Val-Val-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro和少量的Val-Ile-Glu-Thr -Thr-Ala-Ala-Pro 8個(gè)氨基酸組成，串聯(lián)重復(fù)中沒有絲氨酸，串聯(lián)重復(fù)單元中2個(gè)蘇氨酸（Thr）殘基通過羥基與糖鏈連接，形成O-糖苷鍵。單個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域的質(zhì)量約為1 200 Da，包括糖部分（400 Da），糖和蛋白質(zhì)以大約1∶2的比例分享這個(gè)質(zhì)量。大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的天然黏蛋白蛋白質(zhì)主鏈中間或兩端具有與重復(fù)序列不同的其他結(jié)構(gòu)域，與之相比，Q-mucin的結(jié)構(gòu)更加簡(jiǎn)單且具有高度均質(zhì)性，最明顯的不同是Q-mucin缺乏負(fù)責(zé)黏蛋白分子低聚反應(yīng)的特別的結(jié)構(gòu)域如血管性血友病因子D（VWD）和半胱氨酸結(jié)構(gòu)域[18]，推測(cè)可能是因?yàn)镼-mucin來源于一種更原始的生物的原因。

研究發(fā)現(xiàn)，Q-mucin與人體黏蛋白MUC5AC的串聯(lián)重復(fù)（Thr-Thr-Ser-Thr-Thr-Ser-Ala-Pro）有4個(gè)氨基酸相同，形成了經(jīng)典序列-Thr-Thr-X3-Ala-Pro-（X3是Ala或Ser），Ala-Pro部分是周期的標(biāo)志;且2種黏蛋白物理性質(zhì)相似，溶于水都能形成膠狀溶液;推測(cè)Q-mucin也可能屬于凝膠形成黏蛋白[14]。

2.2 Q-mucin的單糖組成

Q-mucin的O-糖鏈的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，糖鏈短（一般為1～3個(gè)糖），不含唾液酸（Sia）。Thr-GalNAc是Q-mucin大部分的糖肽結(jié)合位點(diǎn)，但除了GalNAc，從越前水母、海月水母、水曳水母、海蜇及波布水母（Chiropsalmus quadrigatus）不同部位提取的每一個(gè)Q-mucin中都檢測(cè)到含量相對(duì)較高的Ara和Gal（含量是GalNAc 的10%～70%）[14]，所以推測(cè)少量的GalNAc可能結(jié)合著其他成分。對(duì)海月水母O-糖鏈的結(jié)構(gòu)研究較多。海月水母Q-mucin的O-糖鏈大部分是以3種形式存在的單糖：GalNAC、AEP-（O→6）-GalNAC（AEP為2-氨基乙基膦酸）和P-6-GalNAC，推測(cè)這3種形式可能可以通過水解相互轉(zhuǎn)換[19]。AEP-（O→6）-GalNAC也是越前水母和水曳水母Q-mucin單糖中的一種共有成分，是越前水母提取的Q-mucin的主要O-糖鏈結(jié)構(gòu)[14]。據(jù)推測(cè)，AEP在Q-mucin中可能是作為唾液酸的替代品，用于向糖蛋白傳遞電荷的類似物[20]。

Q-mucin中的單糖組成與脊椎動(dòng)物和其他動(dòng)物內(nèi)的黏蛋白不同，大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的天然黏蛋白的糖基具有多種成分，而在單糖組成上，一般的黏蛋白被認(rèn)為是高爾基復(fù)合體合成的，糖成分只包括5種（Gal、Sia、GlcNAc、Fuc和GalNAc），而Q-mucin糖鏈結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且沒有發(fā)現(xiàn)唾液酸（Sia），這與從脊椎動(dòng)物中提取到的黏蛋白明顯不同。現(xiàn)有的研究還不能確定Q-mucin中檢測(cè)到的除GalNAc以外的其他的糖成分來自雜質(zhì)的可能性，如阿拉伯糖。

2.3 Q-mucin的結(jié)構(gòu)研究方法

雖然從各種天然原料中提取黏蛋白在生物科學(xué)里已經(jīng)有很長(zhǎng)一段歷史，但由于已發(fā)現(xiàn)黏蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，關(guān)于黏蛋白分子水平結(jié)構(gòu)研究的報(bào)道還比較少。因?yàn)榈途厶堑倪B接和每一種單糖的性質(zhì)都可以通過NMR被確定，所以NMR技術(shù)被期望給黏蛋白結(jié)構(gòu)研究帶來一個(gè)相當(dāng)?shù)倪M(jìn)步，但可能是由于天然豐度的完整的黏蛋白的非均質(zhì)的性質(zhì)，至今只有一些結(jié)果被呈現(xiàn)，如綿羊下頜黏蛋白由于其相對(duì)簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)和短的糖鏈，在天然豐度下應(yīng)用NMR技術(shù)已經(jīng)被廣泛研究[19，21]。另外，同位素富集技術(shù)也很難適用于黏蛋白的結(jié)構(gòu)研究。

在水母黏蛋白的研究中，通過幾種NMR技術(shù)獲得了關(guān)于Q-mucin結(jié)構(gòu)的一些關(guān)鍵信息。Q-mucin肽主鏈中質(zhì)子和C13的化學(xué)位移通過幾種技術(shù)（包括DQF-COSY、HMQC/HSQC、HMBC、DPFGSE（雙脈沖梯度自旋回波）-TOCSY）和DPFGSE-NOE的聯(lián)合進(jìn)行檢測(cè)。Thr 和GalNAc在糖支鏈彼此之間的連結(jié)關(guān)系用不同的NMR技術(shù)被確定：通過一個(gè)傳統(tǒng)的HMBC測(cè)量技術(shù)發(fā)現(xiàn)了Thrβ碳原子相對(duì)GalNAc中H-1和那些Thr的β質(zhì)子相對(duì)GalNAc的C1的小的交叉峰，表明2個(gè)Thr殘基都獨(dú)立地與一個(gè)GalNAc相連;DPFGSE-NOE光譜檢測(cè)到來自GalNAc（1）的H-1和Thr（1）的β質(zhì)子及GalNAc（2）中的H-1信號(hào)和Thr（2）的β質(zhì)子之間的NOE。通過一維測(cè)量方法，DPFGSE-NOE-HSD、H-1和Thr的β質(zhì)子之間的NOE進(jìn)一步被發(fā)現(xiàn);TOCSY也提供了關(guān)于Thr-GalNAC的局部結(jié)構(gòu)的信息[6]。通過NMR和ESI-MS/MS技術(shù)確定了海月水母Q-mucin中的AEP-（O→6）-GalNAC的結(jié)構(gòu)[6]。這些研究表明NMR技術(shù)應(yīng)用于分析從天然原料提取并純化的糖蛋白包括黏蛋白的O-糖鏈的結(jié)構(gòu)的可能性，這將為分析其他天然豐度的更復(fù)雜的黏蛋白提供指導(dǎo)。

3 Q-mucin的開發(fā)前景

在水母黏蛋白應(yīng)用方面，目前只有Q-mucin對(duì)關(guān)節(jié)炎修復(fù)能力的研究報(bào)道[15]。研究表明，Q-mucin和透明質(zhì)酸（HA）在體內(nèi)關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中具有協(xié)同作用，同時(shí)，關(guān)節(jié)內(nèi)注射Q-mucin，沒有出現(xiàn)血細(xì)胞和C反應(yīng)蛋白水平的升高及關(guān)節(jié)腫脹、滑膜的現(xiàn)象，而且從沙蜇（S.nomurai）和海月水母中提取的水母黏蛋白表現(xiàn)出基本相同的治療效果;此研究被認(rèn)為有希望開發(fā)為一種軟骨退變治療的新方法[15]?？紤]到從豬胃中提取的胃黏蛋白和牛頜下腺黏蛋白的商業(yè)應(yīng)用，對(duì)Q-mucin的各種其他應(yīng)用也被期待，如作為人體黏液的替代品、藥物控釋的載體、人工細(xì)胞外基質(zhì)的成分、抗生素、化妝品保濕劑和食物添加劑等。另外，由于Q-mucin如人造聚合物一樣簡(jiǎn)單、均勻的結(jié)構(gòu)，雖然目前它的全合成還是不能實(shí)現(xiàn)，但它被期待開發(fā)為一種如幾丁質(zhì)和殼聚糖一樣的單獨(dú)的材料，如將其作為制造像從高級(jí)動(dòng)物中提取的黏蛋白一樣復(fù)雜的黏蛋白的起始材料[20]。同時(shí)，Q-mucin與從昆蟲、魚和植物中提取的抗凍蛋白（AFPs）的結(jié)構(gòu)具有一定相似性。人工合成的結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的一個(gè)AFP是具有串聯(lián)重復(fù)Thr（GalNAc-Gal）-Ala的聚合物。因此，Q-mucin被期待具有相似的抗凍功能[14]。

Q-mucin普遍發(fā)現(xiàn)于不同種類的水母中，而且具有引人注目的高產(chǎn)量，且水母資源量大，而在水母暴發(fā)的季節(jié)，很多水母被作為廢物處理，這些因素使得Q-mucin的大量天然提取是可行的，并且有利于水母資源的開發(fā)利用。同時(shí)水母黏蛋白只有很少的肽序列不同于人體黏蛋白，只有輕微的生物學(xué)反應(yīng)會(huì)以過敏的形式產(chǎn)生。這種低的潛在的生物排斥，是水母黏蛋白應(yīng)用的一個(gè)優(yōu)勢(shì)，也明顯降低了工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[14]。

Q-mucin的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與那些以前發(fā)現(xiàn)的如哺乳動(dòng)物中的黏蛋白明顯不同，推測(cè)可能是由于它來源于一種更原始物種的原因?，F(xiàn)今的生物信息學(xué)分析表明凝膠形成的黏蛋白早期出現(xiàn)在后生動(dòng)物進(jìn)化中，建立在它們的基因出現(xiàn)在一個(gè)星?？?，而星海葵和水母屬于同一類刺胞動(dòng)物。所以Q-mucin的研究也可能會(huì)為生物進(jìn)化的研究提供一定的依據(jù)[22]。對(duì)Q-mucin進(jìn)一步的研究將有助于弄清楚水母中Q-mucin的化學(xué)生態(tài)學(xué)功能以及對(duì)Q-mucin的開發(fā)和應(yīng)用。

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