蛛網(wǎng)膜下腔出血后基底動脈和軟腦膜動脈縫隙連接蛋白表達與血管痙攣的關系

蔡昌呈 雷超 何豹 魏麗麗 趙冬

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是神經(jīng)外科臨床最常見的危急重癥之一。流行病學調查顯示，自發(fā)性SAH占所有腦血管疾病的1%～7%，具有非常高的致死率和致殘率[1]。盡管目前針對SAH的發(fā)病機制與研究有所突破，但SAH后的致死率、致殘率卻未得到明顯改善。腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)的治療一直以來是改善SAH預后的重要方法，但既往針對CVS的治療往往不能取得臨床滿意效果[2]。近年來，眾多學者將研究方向轉向了顱內微血管痙攣。研究證實顱內動脈瘤破裂后會出現(xiàn)腦大血管痙攣[3]；動物實驗發(fā)現(xiàn)，SAH后軟膜微動脈出現(xiàn)了病理性收縮和功能障礙，腦實質微動脈和穿支微動脈亦出現(xiàn)收縮并導致皮層血流減少[4]?？p隙連接蛋白在血管收縮中發(fā)揮重要作用，其基本組成單位為連接蛋白(Connexin，Cx)。血管壁上存在Cx37、Cx40、Cx43和Cx45 4種縫隙連接蛋白。當血管壁中縫隙連接蛋白水平發(fā)生變化時，可導致血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生[5]。該研究通過觀察SAH后軟腦膜微動脈和基底動脈縫隙連接蛋白的變化，以及縫隙連接蛋白在大動脈和微動脈痙攣中的作用差異，從而了解縫隙連接蛋白與血管痙攣之間的關系。

1 材料和方法

1.1 實驗動物選取成年、雄性、健康SD大鼠90只，體重(300±50)g，購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心〔許可證號：SCXK(新)2016-0001〕。大鼠飼養(yǎng)于石河子大學醫(yī)學院動物實驗中心，溫度18～25℃，濕度為40%，光照、黑暗各12 h。將SD大鼠按隨機數(shù)表法分為對照組(21只)、假手術組(20只)、SAH模型組(26只)和18β-甘草次酸(18β-GA)干預組(23只，以下簡稱干預組)。實驗操作符合美國國立衛(wèi)生研究院制定的《實驗動物關懷和使用指南》(1996年修訂版)，同時該研究通過石河子大學實驗動物倫理委員會批準通過。

1.2 主要試劑及設備主要試劑包括RIPA裂解液(P0013B，碧云天)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0011，碧云天)、丙烯酰胺(0341-100G，Amresco)、甲叉丙烯酰胺(0172，Amresco)、PVDF膜(RPN303F，國藥集團化學試劑有限公司)、兔多抗GAPDH(yb-0755R，Abcam)、兔多抗Cx40(yb-465Hu01，Abcam)、鼠單抗Cx43(yb-277Bo01，Abcam)、鼠單抗Cx45(yb-480Gc01)。主要設備包括大鼠腦立體定向儀(ALC-H)、Aquapro超級純水儀(AJY-0502)、石蠟包埋機(KH-BL)、恒溫振蕩器(ZH-D)、光學顯微鏡(LWD200-37FT)、水平電泳儀(EBU-4000)、烘片機(KD-TH1)、離心機(TG16MW)、電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9245AE)等。

1.3 方法

1.3.1SAH模型建立和干預：(1)SAH模型組：根據(jù)改良版顱內視交叉前池二次注血法建立SAH模型[6]。按體重350 mg/kg給予大鼠腹腔注射3%(質量濃度)戊巴比妥鈉麻醉，進行顱內穿刺后借助注射器自股動脈吸取0.2 mL新鮮股動脈血，由PE10管滴注入蛛網(wǎng)膜下腔，骨蠟封閉骨窗，滅菌縫合后正常喂養(yǎng)，48 h后，再次向蛛網(wǎng)膜下腔注入0.2 mL自體動脈血。建模后每天按體重10 mg/kg腹腔注射2%(體積分數(shù))DMSO溶液，至模型建立后第7天。光學顯微鏡下觀察大鼠蛛網(wǎng)膜下腔存在大量紅細胞表明建模成功。(2)假手術組：往蛛網(wǎng)膜下腔注入等量生理鹽水，余步驟同SAH模型組。(3)對照組：不進行任何操作。(3)干預組：在SAH模型操作的基礎上，按體重10 mg/kg腹腔注射含10 mg/mL 18β-GA的2%(體積分數(shù))DMSO溶液，1次/d，共7 d。

1.3.2神經(jīng)行為評分：建模后第7天，采用Garcia神經(jīng)行為學法[7]對SD大鼠進行評分：(1)自主活動：正常活動3分，輕微影響2分，嚴重影響1分，不活動0分；(2)提住鼠尾使大鼠四肢懸空：對稱3分，不對稱2分，偏癱1分；(3)握住鼠尾放置桌面邊緣：對稱3分，輕微不對稱2分，明顯不對稱1分，一側前肢無運動0分；(4)將大鼠置于鐵籠上：攀爬輕松，抓持有力3分，一側受損2分，不能攀爬或傾向于轉圈1分；(5)本體感覺反應：雙側對稱3分，一側刺激遲鈍2分，一側無反應1分；(6)觸碰兩側胡須觀察大鼠反應：對稱3分，不對稱2分，無反應1分。

1.3.3取材：建立模型后第7天，處死大鼠，留取軟腦膜動脈、腦實質內微動脈和基底動脈，提取血管壁中的蛋白，均保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4軟腦膜直徑測定：在顯微鏡下用無齒眼科鑷留取額頂部軟腦膜動脈，除去附在血管上蛛網(wǎng)膜，并用剪刀和鑷子仔細去除微動脈周圍殘留的結締組織，進行HE染色，采用Leica Biosystem掃描切片，再用K-Viewer軟件檢測軟腦膜直徑。

1.3.5壓力肌動圖實驗：按文獻[8]方法進行壓力肌動圖實驗檢測基底動脈血管直徑。在顯微鏡下用無齒眼科鑷輕柔的去除大腦中動脈及蛛網(wǎng)膜后，留取額頂部腦實質的內微動脈，為確保實驗精度，留取腦顳頂部皮質下2 mm左右的實質動脈，借助視頻顯微測量法以及校準視頻尺寸分析器對血管段進行分析與測量。

1.3.6縫隙連接蛋白檢測：按文獻[9]方法取血管組織加入RIPA裂解液提取蛋白后進行電泳、轉膜、免疫，按1∶1000的比例稀釋一抗GADPH、Cx40、Cx43、Cx45；然后放在搖床上于室溫環(huán)境中進行120 min孵育處理，接著和搖床一起置于冰箱(4 ℃)內過夜孵育一抗，然后1×TBST洗膜處理后孵育二抗(1∶5000，由辣根標記)，漂洗后進行顯影、定影，采用蛋白免疫印跡檢測軟腦膜和基底動脈處縫隙連接蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計學處理采用SSPS20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析(One way ANOVA analysis)，兩兩比較采用SNK-q檢驗；相關性分析采用Pearson相關性分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠死亡情況假手術組死亡2只，對照組死亡3只，模型組死亡8只，干預組死亡5只，最終每組18只。

2.2 模型建立假手術組大鼠腦組織腹側Willis環(huán)周圍肉眼未見明顯血凝塊或積血，SAH模型組肉眼可見Willis環(huán)周圍及延髓處可見血凝塊或者積血。光學顯微鏡觀察顯示，假手術組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔未見紅細胞，SAH模型組可見大量紅細胞。表明SAH建模成功。結果見圖1。

2.2 神經(jīng)行為學評分對照組、假手術組、SAH模型組和干預組神經(jīng)行為學評分比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。SAH模型組神經(jīng)行為學評分較假手術組低(P<0.05)，干預組神經(jīng)行為學評分較SAH模型組高(P<0.05)，對照組與假手術組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果見表1。

2.3 動脈直徑比較對照組、假手術組、SAH模型組和干預組大鼠軟腦膜動脈和基底動脈直徑比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。與假手術組比較，SAH模型組軟腦膜動脈和基底動脈直徑均較細(P(0.05)；與SAH模型組比較，干預組軟腦膜動脈和基底動脈直徑均較粗(P<0.05)。結果見表1、圖2～3。

注：SAH：蛛網(wǎng)膜下腔出血，表1、圖2～6同；A、C：假手術組；B、D：SAH模型組 圖1 SD大鼠SAH造模全腦肉眼觀察結果(A、B)及蛛網(wǎng)膜下腔病理觀察結果(C、D，HE染色，比例R=250 μm)

組別n神經(jīng)行為學評分軟腦膜動脈直徑(μm)基底動脈直徑(μm)對照組1817.00±0.6537.16±2.49337.29±19.87假手術組1817.00±0.6136.97±2.78335.61±20.16SAH模型組1811.20±1.47a26.67±3.15a259.38±37.02a干預組1813.50±1.32b33.17±2.83b312.16±29.17bF值5.3524.5263.625P值<0.01<0.05<0.05

注：與假手術組比較，aP<0.05；與SAH模型組比較，bP<0.05

2.4 縫隙連接蛋白表達各組SD大鼠軟腦膜動脈處和基底動脈處縫隙連接蛋白比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。與假手術組比較，SAH模型組軟腦膜動脈處和基底動脈處Cx40蛋白表達水平較低，而Cx43和Cx45蛋白表達水平較高(均P<0.05)；與SAH模型組比較，干預組軟腦膜動脈處和基底動脈處Cx40蛋白表達水平較高，而Cx43和Cx45蛋白表達水平較低(均P<0.05)。結果見表2、圖4。

2.5 動脈直徑與縫隙連接蛋白相關性分析SAH模型組大鼠軟腦膜動脈直徑和基底動脈直徑與Cx40均呈正相關(r=0.749，P<0.05；r=0.866，P<0.05)，而與Cx43和Cx45均呈負相關(r=-0.836)，P<0.05；r=-0.697，P<0.05；r=-0.411，P<0.05；r=-0.979，P<0.05)。結果見圖5、6。

注：A：對照組；B：假手術組；C：SAH模型組；D：干預組 圖2 各組大鼠額頂部軟腦膜動脈直徑(HE染色，×100)

注：A：對照組；B：假手術組；C：SAH模型組；D：干預組 圖3 顯微鏡下觀察各組大鼠額頂腦實質基底動脈血管直徑(×100)

表2 各組SD大鼠不同動脈處縫隙連接蛋白水平比較

組別n軟腦膜動脈處Cx40Cx43Cx45基底動脈處Cx40Cx43Cx45對照組180.88±0.050.65±0.060.60±0.040.65±0.040.51±0.030.43±0.04假手術組180.88±0.040.65±0.050.59±0.050.65±0.050.50±0.040.42±0.05SAH模型組180.75±0.04a0.91±0.04a0.81±0.05a0.45±0.08a0.67±0.04a0.69±0.06a干預組180.81±0.07b0.81±0.08b0.74±0.07b0.61±0.06b0.58±0.05b0.51±0.03bF值13.5961.4768.57611.85115.71613.818P值0.0000.0000.0000.0000.0000.000

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

圖4 各組SD大鼠軟腦膜動脈處(A)和基底動脈處(B)縫隙連接蛋白水平(蛋白免疫印跡)

圖5 SAH模型組大鼠軟腦膜動脈直徑與縫隙連接蛋白相關性分析

圖6 SAH模型組大鼠基底動脈直徑與縫隙連接蛋白相關性分析

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，不同組織分布的血管以及不同類型的血管中縫隙連接蛋白表達水平不同，動物種屬不同縫隙連接蛋白在血管壁內的分布可能亦有所不同[10]。對于循環(huán)系統(tǒng)，Cx37所發(fā)揮的調控機制為腎素分泌[11]。Cx37對血管動脈粥樣硬化斑塊產(chǎn)生發(fā)揮關鍵性影響[12]。

本研究結果顯示，SAH模型組及經(jīng)18β-GA干預組大鼠軟腦膜動脈和基底動脈處Cx40蛋白表達情況均低于假手術組，表明SAH會導致大鼠軟腦膜動脈和基底動脈處Cx40蛋白表達水平降低。有學者發(fā)現(xiàn)敲除Cx40的大鼠會發(fā)生高血壓以及無規(guī)律性動脈收縮表現(xiàn)[13]。Cx40表達減弱時，平滑肌細胞和內皮細胞間通道機能減弱，使內皮源性超級化因子穿過縫隙連接受限，進而對平滑肌細胞舒張機能產(chǎn)生干擾[14]。還有研究證實，如將血管內膜去除，則導致血管完全喪失舒張功能[15]。據(jù)此推測，對于CVS發(fā)生時Cx40具有保護效應，在血管舒張方面發(fā)揮關鍵功能，然而其確切作用機制尚不清楚。

Cx43是縫隙連接蛋白的一種，其廣泛分布在多種組織器官中，特別是在血管內皮細胞及心肌細胞中表達最多，縫隙連接作為細胞間信號傳導的主要形式之一，其若發(fā)生病理變化將會導致多種疾病的發(fā)生。研究證實，細胞表面由Cx43組成的半通道可介導細胞內外物質通訊，通常情況下半通道處于關閉狀態(tài)，可維持細胞的穩(wěn)定性，而在一定條件下(如炎癥刺激、新陳代謝抑制等)半通道可被激活，使縫隙連接開放的扳機點觸發(fā)，從而打開縫隙連接通路，進而使痙攣加劇，加速細胞死亡[16]。通過觀察敲除Cx45蛋白的大鼠發(fā)現(xiàn)，大鼠血管發(fā)生明顯失常改變，提高大鼠死亡概率[17]。本研究結果顯示，與假手術組相比，SAH后軟腦膜動脈和基底動脈處Cx43和Cx45表達水平較高。據(jù)此推測，SAH后軟腦膜動脈和基底動脈處CX43蛋白表達水平升高，將會進一步促使腦血管壁中細胞間收縮信號傳導增加，最終造成CVS的發(fā)生。目前尚缺乏有關SAH后腦血管內Cx45變化的相關研究，SAH與腦血管內Cx45的確切關系有待進一步深入分析。

本研究通過分析軟腦膜血管直徑和基底動脈血管直徑與縫隙連接蛋白表達水平的相關性發(fā)現(xiàn)，軟腦膜處和基底動脈處Cx40表達與軟腦膜動脈直徑和基底動脈直徑均呈正相關，而Cx43和Cx45表達水平與兩動脈直徑均呈負相關，提示軟腦膜動脈處Cx40對緩解CVS起主要作用，而Cx43和Cx45升高可加重CVS。該研究結果顯示，SAH模型組大鼠經(jīng)縫隙連接蛋白非特異性阻斷劑18β-GA干預后，軟腦膜動脈處和基底動脈處Cx40蛋白表達水平較高，而Cx43和Cx45蛋白表達水平較低，從側面表明縫隙連接蛋白與CVS具有相關性。

綜上所述，大鼠SAH后，軟腦膜動脈和基底動脈縫隙連接蛋白發(fā)生改變，縫隙連接蛋白和CVS具有相關性，經(jīng)18β-GA干預后可緩解血管痙攣。深入研究縫隙連接蛋白表達和血管痙攣之間的相關性，可為今后腦血管病的防治奠定理論基礎。