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    CNQX拮抗斷尾誘發(fā)小鼠前扣帶回皮質(zhì)神經(jīng)元c-fos基因的表達(dá)

    2020-05-20 01:48:50李娜然商麗宏楊宇姚陽(yáng)吳敏范
    關(guān)鍵詞:斷尾中樞截肢

    李娜然,商麗宏,楊宇,姚陽(yáng),吳敏范

    (沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 1.機(jī)能與形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心;2.生理學(xué)教研室,沈陽(yáng) 110034)

    研究[1-2]表明,截肢手術(shù)后有50%~60%以上的患者伴有幻肢痛(phantom limb pain,PLP)。前扣帶回皮質(zhì)(anterior cingulate cortex,ACC)已被大量的研究[3-4]證明是痛覺的重要中樞,在疼痛感知、認(rèn)知和情緒等關(guān)鍵大腦功能中發(fā)揮重要作用。PLP患者ACC的腦血容量顯著增加,與疼痛強(qiáng)度密切相關(guān)[5];截肢后大鼠ACC對(duì)外周刺激與中樞刺激的反應(yīng)增強(qiáng)[6];神經(jīng)元的c-fos基因表達(dá)[7]、NK-1受體[8]、AMPA/Kainate受體[9]與痛覺有關(guān)。目前,PLP的發(fā)病機(jī)理尚不清楚。將小鼠尾末端截?cái)喑S糜赑LP產(chǎn)生機(jī)制的研究[4]。研究[8]表明,NK-1受體參與斷尾引起小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)的過程。但是,AMPA/Kainate受體是否參與此過程尚未見報(bào)道。因此,本研究采用免疫組化方法探討PLP的產(chǎn)生機(jī)理,為治療PLP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)分組

    沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供雌性成年昆明種小鼠36只,體質(zhì)量(27±6)g[動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào):SCXK(遼)2010-0001]。1%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1體質(zhì)量腹腔麻醉小鼠,隨機(jī)均分為6組,每組6只:空白對(duì)照組(不做任何處理);斷尾(尾末端2.5 cm用剪刀截?cái)啵┖?.5 h組;iv CNQX組(尾靜脈注射1%CNQX 1 mg·kg-1體質(zhì)量后10 min+斷尾后0.5 h);iv NS組(尾靜脈注射同體積生理鹽水后10 min+斷尾后0.5 h);ith CNQX組(蛛網(wǎng)膜下腔注射CNQX 10 μg·10 μL-1生理鹽水后10 min+斷尾后0.5 h);ith NS組(蛛網(wǎng)膜下腔注射同體積生理鹽水后10 min+斷尾后0.5 h)。

    1.2 ACC c-fos基因表達(dá)的檢測(cè)

    斷尾后0.5 h,將上述各組小鼠斷頭,取腦,置于4 ℃ 4%多聚甲醛中過夜固定。連續(xù)冠狀面-20 ℃冰凍切片,厚度為15 μm,用免疫組化方法常規(guī)染片及洗片等,最后使用樹膠封片。使用顯微圖像分析儀(×400放大倍數(shù))檢測(cè)切片ACCc-fos陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度(integrated optical density,integrated OD)和面積百分比。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 iv CNQX對(duì)斷尾誘發(fā)小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)的影響

    空白對(duì)照組正常小鼠ACC神經(jīng)元有少量c-fos基因表達(dá),而斷尾后0.5 h小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng),陽(yáng)性細(xì)胞OD和面積百分比顯著高于空白對(duì)照組(P< 0.01);iv CNQX拮抗斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng),陽(yáng)性細(xì)胞OD和面積百分比與空白對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但顯著低于斷尾后0.5 h組(P< 0.01),而ivNS組斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)沒有影響,陽(yáng)性細(xì)胞OD和面積百分比顯著高于空白對(duì)照組及iv CNQX組(P< 0.01),見表1,圖1。

    2.2 ith CNQX對(duì)斷尾誘發(fā)小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)的影響

    表1 尾靜脈或蛛網(wǎng)膜下腔注射CNQX對(duì)斷尾誘發(fā)小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)的影響Tab.1 Effect of iv or ith CNQX on tail amputation induced c-fos gene expression in the ACC neurons in mice

    圖1 iv CNQX對(duì)斷尾誘發(fā)小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)的影響 ×400Fig.1 Effect of iv CNQX on tail amputation induced c-fos gene expression in the ACC neurons in mice ×400

    與空白對(duì)照組正常小鼠比較,斷尾后0.5 h小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)(P< 0.01);ith CNQX拮抗斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng),陽(yáng)性細(xì)胞OD和面積百分比與空白對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05),但是,顯著低于斷尾后0.5 h組(P< 0.01),而ith NS組對(duì)斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)沒有影響,陽(yáng)性細(xì)胞OD和面積百分比顯著高于空白對(duì)照組及ith CNQX組(P<0.01),見表1,圖2。

    3 討論

    圖2 Ith CNQX對(duì)斷尾誘發(fā)小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)的影響 ×400Fig.2 Effect of ith CNQX on tail amputation induced c-fos gene expression in the ACC neurons in mice ×400

    c-fos基因及Fos蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的部位與傷害性信號(hào)的傳導(dǎo)、整合分析有關(guān)[7-8];大鼠截肢后ACC對(duì)外周刺激與中樞刺激的反應(yīng)增強(qiáng)[6]。本研究發(fā)現(xiàn),斷尾后0.5 h小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng),表明小鼠ACC的神經(jīng)元能接受傷害信號(hào)的傳入,參與斷尾產(chǎn)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性改變。本研究結(jié)果為深入研究PLP提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    PLP是截肢者術(shù)后常見的并發(fā)癥。目前,PLP的發(fā)病機(jī)理尚不明確。NK-1受體、AMPA/Kainate受體與痛覺有關(guān)[8-9]。NK-1受體參與斷尾引起小鼠ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)的過程[8]。但是,AMPA/Kainate受體是否參與此過程尚未見報(bào)道。本研究觀察到iv CNQX AMPA/Kainate受體拮抗劑拮抗斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng),說明外周AMPA/Kainate受體參與此過程。CNQX不易透過血腦屏障,因此本文深入研究了ith CNQX對(duì)斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)顯著增強(qiáng)的影響。發(fā)現(xiàn)ith CNQX拮抗了斷尾誘發(fā)的ACC神經(jīng)元c-fos基因表達(dá)的顯著增強(qiáng),說明中樞AMPA/Kainate受體也參與了此過程,外周與中樞AMPA/Kainate受體可能作為鎮(zhèn)痛藥物治療PLP的候選靶點(diǎn)。

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