胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路活化促進(jìn)?？颂婺崮退幍姆切〖?xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移

楊旸，王一喆，鄭春雷，侯科佐，王曉楠，胡雪君

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.老年呼吸感染科；2.腫瘤內(nèi)科，遼寧省抗腫瘤藥物與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110001）

肺癌的發(fā)病率和死亡率在我國乃至世界范圍內(nèi)均居惡性腫瘤之首，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占所有類型肺癌的85%。由于缺乏早期臨床表現(xiàn)，40%的NSCLC發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)轉(zhuǎn)移（Ⅳ期），晚期NSCLC是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。傳統(tǒng)的以鉑類為基礎(chǔ)的治療方案對NSCLC的療效目前已達(dá)到平臺期，隨著對癌癥相關(guān)基因及通路的進(jìn)一步深入研究，表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）成為晚期NSCLC的主要治療手段。EGFR-TKI能夠顯著延長EGFR突變的NSCLC患者的無進(jìn)展生存期，并改善患者生活質(zhì)量。埃克替尼是口服選擇性EGFR-TKI，是我國第一個擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的EGFR-TKI，也是全球第3個上市的EGFR-TKI。2011年6月被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于晚期NSCLC的治療。在NSCLC的治療中，埃克替尼發(fā)揮了良好的抗腫瘤作用［1］，尤其對晚期NSCLC復(fù)發(fā)的療效良好。目前，埃克替尼已成為中國治療晚期NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)藥物之一［2］。

雖然EGFR-TKI在NSCLC中療效顯著，但接受靶向治療的患者經(jīng)過10～14個月無進(jìn)展生存期后大多數(shù)還是會出現(xiàn)耐藥和腫瘤復(fù)發(fā)。因此，深入探討EGFR-TKI耐藥肺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性，對于理解耐藥機(jī)制及探索新的耐藥逆轉(zhuǎn)策略具有重要意義。研究報道，化療藥物和TKI等靶向藥物耐藥后，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［3-4］，其機(jī)制與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）表型和細(xì)胞干性增強(qiáng)相關(guān)［5］。然而，?？颂婺崮退幖?xì)胞的轉(zhuǎn)移能力是否增強(qiáng)以及其促轉(zhuǎn)移機(jī)制目前尚不十分明確。研究［6-9］表明，在TKI耐藥的NSCLC、慢性粒細(xì)胞白血病和黑色素瘤中均存在胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路持續(xù)活化。在EGFR-TKI耐藥的NSCLC細(xì)胞中，抑制ERK通路可以有效逆轉(zhuǎn)耐藥［6］。然而，關(guān)于ERK通路是否促進(jìn)?？颂婺崮退幍姆伟┘?xì)胞轉(zhuǎn)移的研究甚少。本研究探討了NSCLC中ERK通路活化對?？颂婺崮退幖?xì)胞遷移和侵襲能力的影響，旨在為逆轉(zhuǎn)EGFRTKI耐藥提供新的可能途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑

?？颂婺嵊烧憬愡_(dá)藥業(yè)提供，PD98059、EGFR、phosph-EGFR、ERK、phosph-ERK抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與耐藥細(xì)胞系建立

人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9和PC9/IcoR培養(yǎng)于含10%胎牛血清（以色列Biological Industries公司）、1%青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱條件為5%CO2、37 ℃恒溫。PC9細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/IcoR的獲得：使PC9細(xì)胞株持續(xù)暴露于初始濃度為0.05 μmol/L的?？颂婺嶂校饾u增加藥物濃度，直到藥物濃度達(dá)到10 μmol/L，篩選此時穩(wěn)定存活的細(xì)胞。PC9和PC9/IcoR細(xì)胞株每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT檢測細(xì)胞增殖能力

采用MTT比色法測定?？颂婺釋?xì)胞活力的影響，將PC9和PC9/IcoR細(xì)胞以3 000/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后加入不同濃度（0、0.1、1、10和20 μmol/L）的?？颂婺崂^續(xù)培養(yǎng)96 h。檢測ERK通路對PC9/IcoR細(xì)胞活力的影響，分別用不同濃度（0、10、20和40 μmol/L）的ERK通路抑制劑PD98059（PD98059組）以及上述濃度的PD98059與10 μmol/L?？颂婺崧?lián)合（兩藥聯(lián)用組）作用細(xì)胞24 h，每個藥物濃度設(shè)置4個復(fù)孔并設(shè)置對照孔。之后每孔加入20 μL MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清，加入DMSO 200 μL/孔，震蕩15～20 min。酶標(biāo)儀檢測570 nm波長的吸光度值，計算藥物作用下的細(xì)胞活力。

1.4 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

采用孔徑為8 μm的Transwell小室和配套的24孔板。將對數(shù)生長期的PC9和PC9/IcoR細(xì)胞消化并用PBS清洗后，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，制備上室細(xì)胞懸液200 μL（3.0×104個細(xì)胞），下室加入2.5%血清的培養(yǎng)基500μ L。檢測ERK通路對PC9/IcoR細(xì)胞遷移能力的影響，分別用10 μmol/L的埃克替尼（?？颂婺峤M）、20 μmol/L的PD98059（PD98059組）和兩藥聯(lián)合（兩藥聯(lián)用組）預(yù)處理細(xì)胞4 h，并設(shè)置對照組。分別于上室和下室加入相應(yīng)濃度的藥物，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，棄去小室中培養(yǎng)液清洗并風(fēng)干，瑞氏-吉姆薩染色法染色固定。顯微鏡下觀察拍照，每個小室隨機(jī)選取3個視野計數(shù)，每個實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5 基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

將基質(zhì)膠與RPMI 1640培養(yǎng)基以1 ∶30比例稀釋后，鋪于小室中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中30～40 min使其凝固。將PC9和PC9/IcoR細(xì)胞胰蛋白酶消化并用PBS洗滌后，以3.0×104/孔接種于Transwell小室的上室，終體積200 μL。下室加入含2.5%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，終體積500 μL。檢測ERK通路對PC9/IcoR細(xì)胞侵襲能力的影響，分別用10 μmol/L的?？颂婺幔ò？颂婺峤M）、20 μmol/L的PD98059（PD98059組）和兩藥聯(lián)合（兩藥聯(lián)用組）預(yù)處理細(xì)胞4 h，并設(shè)置對照組。分別于上室和下室加入相應(yīng)濃度的藥物，24孔板于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，清洗風(fēng)干后用瑞氏-吉姆薩染色法染色固定45 min～1 h。再次清洗晾干后于顯微鏡下觀察，每個小室隨機(jī)選取3個視野拍照、計數(shù)。

1.6 Western blotting檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)

將PC9和PC9/IcoR細(xì)胞冰上裂解，裂解后的細(xì)胞懸液于4 ℃超聲離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度。檢測ERK通路對PC9/IcoR細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響，分別用10 μmol/L的埃克替尼（?？颂婺峤M）、20 μmol/L的PD98059（PD98059組）和兩藥聯(lián)合（兩藥聯(lián)用組）作用細(xì)胞24 h再收集細(xì)胞蛋白，并設(shè)置對照組。定量后取20～40 μg蛋白在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，并濕法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。室溫下5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1 h，加入相應(yīng)的一抗于4 ℃過夜。1×PBS清洗一抗4次后，加入二抗室溫封閉30～40 min，再用PBS清洗4次并顯像分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?？颂婺釋?xì)胞增殖能力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證?？颂婺釋C9和PC9/IcoR細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)果顯示，埃克替尼作用96 h后，不同濃度（0.1、1、10、20 μmol/L）的埃克替尼均對PC9細(xì)胞產(chǎn)生增殖抑制作用，且增殖抑制作用隨著?？颂婺釢舛鹊脑黾佣黾?，與PC9/IcoR細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜ 0.05），而在?？颂婺嶙饔孟翽C9/IcoR細(xì)胞的增殖未受到明顯抑制。見圖1。結(jié)果提示，PC9/IcoR細(xì)胞具有較強(qiáng)且較穩(wěn)定的?？颂婺崮退幪匦浴?/p>

圖1 ?？颂婺釋C9和PC9/IcoR細(xì)胞增殖能力的影響Fig.1 Effect of icotinib on the proliferation of PC9 and PC9/IcoR cells

2.2 PC9和PC9/IcoR細(xì)胞遷移和侵襲能力的比較

Transwell小室法檢測PC9和PC9/IcoR細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，24 h后穿過小室和基質(zhì)膠的PC9/IcoR細(xì)胞數(shù)量明顯多于PC9細(xì)胞（24 h PC9與PC9/IcoR細(xì)胞的增殖能力并無明顯差異），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。結(jié)果提示，與親本細(xì)胞PC9相比，耐藥細(xì)胞PC9/IcoR具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。見圖2。

2.3 PC9和PC9/IcoR細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況

圖2 PC9和PC9/IcoR細(xì)胞遷移和侵襲能力的比較Fig.2 Comparison of the migration and invasion abilities between PC9 and PC9/IcoR cells

Western blotting檢測PC9和PC9/IcoR細(xì)胞中ERK、phosph-ERK、EGFR、phosph-EGFR蛋白的表達(dá)水平。PC9細(xì)胞雖然均有一定程度的EGFR和ERK磷酸化（phosph-EGFR、phosph-ERK），但是PC9/IcoR細(xì)胞中phosph-EGFR和phosph-ERK水平明顯升高。見圖3。由此可見，ERK通路活化可能與耐藥細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。

圖3 PC9和PC9/IcoR細(xì)胞的蛋白表達(dá)Fig.3 The expression of proteins in PC9 and PC9/IcoR cells

2.4 PD98059對PC9/IcoR細(xì)胞增殖能力和ERK通路的影響

Western blotting結(jié)果顯示，PD98059組phosph-ERK蛋白表達(dá)水平明顯降低，兩藥聯(lián)用組phosph-ERK蛋白下調(diào)最明顯（P＜ 0.05，圖4A）。MTT結(jié)果顯示，無論在何種藥物濃度作用下，PD98059組和兩藥聯(lián)用組細(xì)胞增殖能力均無明顯下降（P＞ 0.05，圖4B）。結(jié)果提示，ERK通路對PC9/IcoR細(xì)胞增殖無影響。

2.5 抑制ERK通路對PC9/IcoR細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

與對照組相比，?？颂婺峤M穿過小室及基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量未見明顯變化，結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；PD98059組遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；兩藥聯(lián)用組細(xì)胞遷移和侵襲能力被抑制最為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。結(jié)果提示，ERK通路活化促進(jìn)PC9/IcoR細(xì)胞的遷移和侵襲。見圖5。

圖4 抑制ERK對PC9/IcoR細(xì)胞增殖和蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of ERK inhibition on the proliferation and protein expression of PC9/IcoR cells

3 討論

雖然EGFR-TKI可以明顯提高EGFR突變的NSCLC患者的生存率，耐藥仍然是治療中的主要障礙。常見的耐藥機(jī)制包括T790M突變、MET擴(kuò)增、胰島素樣生長因子1受體通路激活等?，F(xiàn)有研究［10］顯示，EGFR-TKI耐藥的肺腺癌細(xì)胞除對TKI的敏感性降低之外，還獲得了更強(qiáng)的侵襲和遷移能力。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，EMT、EGF通路激活和MET擴(kuò)增均促進(jìn)了EGFR-TKI耐藥NSCLC的遷移和侵襲。本研究結(jié)果與既往研究一致，與PC9細(xì)胞系相比，PC9/IcoR耐藥細(xì)胞系遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，提示腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲是埃克替尼耐藥的特征之一。

ERK通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、分化和運(yùn)動的主要微環(huán)境調(diào)節(jié)級聯(lián)信號通路之一，在人類腫瘤中常被激活。在某些情況下，ERK通路活化可以刺激正常組織細(xì)胞的增殖和運(yùn)動失控進(jìn)而向惡性轉(zhuǎn)化。目前已有多項研究報道，在TKI耐藥的腫瘤細(xì)胞中存在ERK通路的持續(xù)活化。HANLY等［11］的研究表明，維羅非尼耐藥的甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中ERK過度活化。伊馬替尼耐藥的慢性粒細(xì)胞白血病中存在ERK通路持續(xù)活化，吉非替尼耐藥的NSCLC中ERK通路過度活化［12］。JANMAAT等［13］報道了吉非替尼耐藥的NSCLC細(xì)胞系中存在EGFR非依賴性Ras/ERK通路持續(xù)活化。本研究結(jié)果顯示，PC9/IcoR耐藥細(xì)胞中ERK磷酸化水平明顯高于PC9細(xì)胞，提示耐藥細(xì)胞中ERK通路活化程度更高，與上述研究結(jié)果一致。

圖5 抑制ERK對PC9/IcoR細(xì)胞遷移和侵襲的影響Fig.5 Effect of ERK inhibition on the migration and invasion abilities of PC9/IcoR cells

除在TKI耐藥的腫瘤中持續(xù)活化外，ERK通路還可以調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移。研究［14］顯示，ERK通路的激活在乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。在胃癌中抑制MAPK/ERK信號通路可以阻止腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲［15］。2017年的一項研究［16］表明，在PD-L1/BAG-1高表達(dá)的NSCLC患者中，聯(lián)合應(yīng)用TKI與ERK抑制劑可以克服PD-L1介導(dǎo)的腫瘤侵襲和TKI抗性。由于在PC9/IcoR耐藥細(xì)胞系中ERK活化與細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)變化趨勢一致，本研究采用PD98059作用于PC9/IcoR細(xì)胞后，觀察細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化，進(jìn)一步探究兩者之間是否存在關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，在不影響細(xì)胞增殖情況下，ERK活性被抑制后，PC9/IcoR細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降，當(dāng)PD98059與?？颂婺崧?lián)用時，細(xì)胞遷移和侵襲能力被抑制最明顯。由此可見，在埃克替尼耐藥的NSCLC中，ERK通路活化促進(jìn)耐藥細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究明確了ERK通路活化與EGFR-TKI耐藥細(xì)胞遷移和侵襲之間的關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果提示，在EGFR-TKI耐藥的NSCLC中，抑制ERK通路可以抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，也為逆轉(zhuǎn)TKI耐藥提供新的思路，可在臨床治療中試驗(yàn)性應(yīng)用。