丹參酮ⅡA誘導(dǎo)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化、提高預(yù)分化細(xì)胞歸巢能力的研究

樊晨星，王秀艷，趙千，賴紅，李昆

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗科，遼寧 錦州 121001；3.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，沈陽 110122）

利用干細(xì)胞的分化潛能再生心肌細(xì)胞已成為治療缺血性心臟病的一種新策略。由于心肌分化調(diào)控的復(fù)雜性，無法保證移植入體內(nèi)的干細(xì)胞會向心肌細(xì)胞分化的同時不伴有基因突變的發(fā)生，因此，移植心肌前體細(xì)胞較移植干細(xì)胞更為安全有效［1］。目前，人體來源的干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞主要有2種方法，一是通過與異種動物心肌細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，模擬心肌微環(huán)境，促進(jìn)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化［2］；一是通過小分子化合物，如5-氮胞苷等，誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化［3］。但前者容易將外源性有害基因帶入人體，后者由于劇毒性使其使用劑量受限，導(dǎo)致誘導(dǎo)效率低下。因此，亟需尋找一種更為安全有效的心肌分化誘導(dǎo)劑。丹參酮ⅡA是我國傳統(tǒng)中藥丹參的有效成分，因其具有心血管保護(hù)作用，廣泛應(yīng)用于缺血性心臟病的治療［4］。前期研究［5-7］發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能夠誘導(dǎo)人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（human placenta-derived mesenchymal stem cells，hPDMSCs）向心肌細(xì)胞分化，效果優(yōu)于共培養(yǎng)法和5-氮胞苷誘導(dǎo)法。本研究擬評估丹參酮ⅡA對hPDMSCs向心肌細(xì)胞分化及對預(yù)分化細(xì)胞歸巢能力的影響，并探討其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

丹參酮ⅡA粉末（20 mg，純度≥98%）購自上海江萊生物科技有限公司；β-catenin激動劑WAY-262611（1 mg粉末，純度≥99.09%）購自上海陶素生化科技有限公司；胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基和青鏈霉素購自美國Gibco公司；抗心肌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子4（GATA-binding protein 4，GATA-4）、抗心鈉素（atrial natriuretic peptide，ANP）、抗α-橫紋肌肌動蛋白（α-sarcomeric actin，α-SCA）、抗心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponin I，cTnI）、抗后促進(jìn)因子（anaphase promoting factor，APC）、抗糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，Gsk-3β）、抗β-catenin、抗CXC趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR-4）、抗CC趨化因子受體2（CC chemokine receptor 2，CCR-2）購自美國Abcam公 司；抗CD13、抗CD73、抗CD90、抗CD166、抗人白細(xì)胞抗原DR（human leukocyte antigen DR，HLADR）、抗CD14、抗CD29、抗CD31、抗CD44、抗CD45、抗CD105、抗人白細(xì)胞抗原ABC（human leukocyte antigen ABC，HLA-ABC）抗體均購自美國BD Biosciences公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒、ECL超敏化學(xué)發(fā)光顯影液等購自北京碧云天科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 hPDMSCs的分離鑒定：采用組織塊分離法培養(yǎng)hPDMSCs［5］。取第3代細(xì)胞，待其長滿培養(yǎng)皿底部后，用胰酶消化處理，PBS洗滌2次，計數(shù)1×106細(xì)胞置于樣品管中，分別加入FITC標(biāo)記的鼠抗人的HLAABC、CD29、CD31、CD44、CD45、CD14、CD105抗體和PE標(biāo)記的鼠抗人HLA-DR、CD13、CD73、CD90、CD166抗體，4 ℃避光孵育20 min，同時設(shè)置空白對照組，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞上述抗原的表達(dá)情況。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：前期研究［7］顯示，0.1 mg/L丹參酮ⅡA對hPDMSCs沒有細(xì)胞毒性，且誘導(dǎo)hPDMSC向心肌細(xì)胞分化的效果優(yōu)于丹參，故仍然選擇0.1 mg/L丹參酮ⅡA用于本研究。將hPDMSCs分別接種于96孔板和10 cm培養(yǎng)皿中（1×103/cm2），用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)；次日，分別加入0.1 mg/L丹參酮ⅡA或0.1 mg/L丹參酮ⅡA+0.1 μmol/L β-catenin激動劑WAY-262611，同時設(shè)置不加藥的對照組，每4 d換液1次，3-（4，5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑［3（-4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5（-3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-tetrazolium，MTS］法檢測細(xì)胞的增殖情況，20 d終止實驗，收集細(xì)胞進(jìn)行Western blotting檢測。

1.2.3 劃痕實驗：將hPDMSCs接種于6孔板中（1.5×103/cm2），用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)；次日，分別加入0.1 mg/L丹參酮ⅡA或0.1 mg/L丹參酮ⅡA+0.1 μmol/L β-catenin激動劑WAY-262611，同時設(shè)置不加藥的對照組，每4 d換液1次。培養(yǎng)2周后，用200 μL的槍頭做十字劃痕，吸去完全培養(yǎng)基，更換為含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)［8］，分別用0.1 mg/L丹參酮ⅡA、0.1 mg/L丹參酮ⅡA+0.1 μmol/L β-catenin激動劑WAY-262611干預(yù)24 h后，于顯微鏡下拍照，觀察相同部位細(xì)胞向損傷區(qū)遷移的情況。

1.2.4 Western blotting：收集細(xì)胞于EP管中，加入裂解液，-20 ℃過夜；渦旋裂解，4 ℃、12 000 r/min離心25 min，收集總蛋白并定量；加入等量蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入抗GAPDH、抗GATA-4、抗ANP、抗α-SCA、抗cTnI、抗APC、抗Gsk-3β、抗β-catenin、抗CXCR-4、抗CCR-2抗體，4 ℃孵育過夜；洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h；超敏化學(xué)發(fā)光顯影液顯色，自動電泳凝膠成像儀采集圖像，檢測灰度值，以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，采用表示，采用t檢驗比較組間差異，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hPDMSCs的提取與鑒定

分離培養(yǎng)3～5 d時，組織塊周圍有少量呈短梭形、形態(tài)飽滿的細(xì)胞爬出；隨著細(xì)胞不斷向外擴增，逐漸變成長梭形并形成細(xì)胞集落；第3周時，細(xì)胞達(dá)80%～90%融合；經(jīng)傳代貼壁后，細(xì)胞重新變成長梭形并形成細(xì)胞集落（圖1A）。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，來源人胎盤組織的第3代細(xì)胞，表達(dá)CD13、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、HLA-ABC，不 表達(dá)CD14、CD31、CD45、HLA-DR（圖1B），呈現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記特性。

2.2 丹參酮ⅡA干預(yù)對hPDMSCs的增殖及形態(tài)的影響

如圖2所示，培養(yǎng)12 d內(nèi)，對照組細(xì)胞增殖速度較快，隨后由于細(xì)胞密度較大而出現(xiàn)接觸性抑制，增殖減慢，整個過程中細(xì)胞始終保持成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。與對照組相比，丹參酮ⅡA干預(yù)組細(xì)胞長勢緩慢，部分細(xì)胞逐漸增大并形成棒狀外觀，且細(xì)胞間出現(xiàn)很多連接細(xì)胞的分支。

2.3 丹參酮ⅡA干預(yù)對心肌特異性蛋白GATA-4、ANP、α-SCA、cTnI表達(dá)及預(yù)分化細(xì)胞向損傷區(qū)遷移能力的影響

如圖3所示，與對照組比較，丹參酮ⅡA組細(xì)胞心肌特異性蛋白GATA-4、ANP、α-SCA、cTnI的表達(dá)明顯增多（P＜ 0.05），且向損傷區(qū)遷移的能力明顯增強（P＜ 0.05）。

2.4 丹參酮ⅡA干預(yù)對Wnt/β-catenin通路中相關(guān)蛋白APC、Gsk-3β、β-catenin及與歸巢相關(guān)的趨化因子CXCR-4、CCR-2表達(dá)的影響

圖3 丹參酮ⅡA干預(yù)前后心肌特異性蛋白的表達(dá)變化及預(yù)分化細(xì)胞向損傷區(qū)遷移的情況Fig.3 Changes of myocardial specific protein expression and migration of pre-differentiated cells to the injured area before and after tanshinone ⅡA intervention

如圖4所示，與對照組比較，丹參酮ⅡA組干預(yù)細(xì)胞APC、Gsk-3β、CXCR-4、CCR-2的表達(dá)明顯增多（P＜ 0.05），β-catenin的表達(dá)明顯減少（P＜ 0.05）。

2.5 β-catenin激動劑WAY-262611對丹參酮ⅡA誘導(dǎo)hPDMSCs向心肌分化、提高預(yù)分化細(xì)胞向損傷區(qū)歸巢能力的影響

經(jīng)β-catenin激動劑WAY-262611干預(yù)后，丹參酮ⅡA組干預(yù)細(xì)胞β-catenin表達(dá)明顯增多（P＜ 0.05）（圖5A），說明β-catenin激動劑WAY-262611干預(yù)有效；雖然丹參酮ⅡA能夠抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞心肌樣形態(tài)改變，但經(jīng)β-catenin激動劑WAY-262611干預(yù)后，細(xì)胞的增殖速度明顯增快，且呈長梭形集落狀生長（圖5B、5C）；與丹參酮ⅡA干預(yù)組相比，丹參酮ⅡA+β-catenin激動劑WAY-262611干預(yù)組細(xì)胞心肌特異性蛋白GATA-4、ANP、α-SCA、cTnI的表達(dá)明顯減少（P＜ 0.05）（圖5D），且細(xì)胞向損傷區(qū)遷移的能力明顯下降（圖5E），與細(xì)胞歸巢相關(guān)的趨化因子CXCR-4、CCR-2的表達(dá)也明顯減少（P＜ 0.05）（圖5F）。

圖4 丹參酮ⅡA干預(yù)前后Wnt/β-catenin通路中相關(guān)蛋白及與歸巢相關(guān)的趨化因子的表達(dá)變化情況Fig.4 Expressions of the related proteins in Wnt/β-catenin pathway and the homing-related chemokines before and after intervention with tanshinone ⅡA

3 討論

胎盤中存在大量易于提取分離的間充質(zhì)干細(xì)胞，這些細(xì)胞能表達(dá)某些胚胎干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，提示hPDMSCs具有很強的自我更新和分化能力；而且，hPDMSCs不僅免疫原性較低，還具有免疫調(diào)節(jié)特性［9］。因此，hPDMSCs在同種同體及同種異體移植治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

缺血性心臟病所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞不可逆的死亡是心功能不全的主要原因。盡管溶栓、介入和冠狀動脈旁路搭橋等血運重建技術(shù)能夠改善冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的缺血狀態(tài)，但卻不能彌補損失的心肌細(xì)胞。利用干細(xì)胞增殖分化潛能，再生心肌細(xì)胞，修復(fù)受損心肌組織，恢復(fù)心臟功能，已成為治療缺血性心臟病的一種新策略。但由于心肌分化調(diào)控的復(fù)雜性，還不能保證移植入體內(nèi)的干細(xì)胞會向心肌細(xì)胞分化的同時不伴有基因突變的發(fā)生，因此，移植心肌前體細(xì)胞較移植干細(xì)胞更為安全有效［1］。在眾多誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌前體細(xì)胞分化的方式中，共培養(yǎng)法和5-氮胞苷誘導(dǎo)法最為常用。但是，這2種方法都存在不足，尚不能廣泛應(yīng)用于臨床上的心肌再生。另外，在干細(xì)胞通過再生心肌細(xì)胞修復(fù)受損心肌組織的過程中，除被移植的干細(xì)胞能否分化為心肌細(xì)胞外，另一個制約心肌再生和修復(fù)的因素是分化細(xì)胞向損傷區(qū)歸巢（即遷移運動）的能力。

心臟由中胚層發(fā)育而來，其形成和發(fā)育過程十分復(fù)雜，涉及眾多信號通路的參與，其中，Wnt/β-catenin通路發(fā)揮著不可替代的作用。研究［10-11］顯示，在中胚層形成以后，抑制Wnt/β-catenin通路可以完全并有效地指定中胚層細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。此外，Wnt/β-catenin通路也參與細(xì)胞遷移運動能力的調(diào)控。細(xì)胞的遷移運動能力涉及趨化因子、生長因子、黏附分子等的參與［12-14］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)丹參酮ⅡA干預(yù)后，hPDMSCs的增殖速度明顯減慢，心肌特異性蛋白GATA-4、ANP、α-SCA、cTnI的表達(dá)明顯增加；在這一過程中，Wnt/β-catenin通路中的APC、Gsk-3β的表達(dá)明顯增加，β-catenin明顯減少，預(yù)分化細(xì)胞向損傷區(qū)遷移運動的能力明顯增強，和與歸巢相關(guān)的趨化因子CXCR-4、CCR-2的表達(dá)增加一致。因此，推測丹參酮ⅡA通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路誘導(dǎo)hPDMSCs向心肌細(xì)胞分化，提高預(yù)分化細(xì)胞歸巢能力。為了進(jìn)一步驗證這一推測，本研究應(yīng)用β-catenin激動劑WAY-262611干預(yù)了丹參酮ⅡA誘導(dǎo)分化體系，結(jié)果顯示，β-catenin激動劑WAY-262611干預(yù)后，細(xì)胞生長速度明顯增快，與單獨丹參酮ⅡA干預(yù)相比，丹參酮ⅡA+β-catenin激動劑WAY-262611干預(yù)后，心肌特異性蛋白GATA-4、ANP、α-SCA、cTnI的表達(dá)明顯減少，細(xì)胞遷移明顯受到抑制，與歸巢相關(guān)的趨化因子CXCR-4、CCR-2的表達(dá)也明顯減少。

圖5 β-catenin激動劑WAY-262611干預(yù)前后β-catenin蛋白、細(xì)胞增殖形態(tài)、心肌特異性蛋白、預(yù)分化細(xì)胞向損傷區(qū)遷移及與歸巢相關(guān)的趨化因子表達(dá)變化的情況Fig.5 Changes in β-catenin expression，cell proliferation，cell morphology，cardiac-specific proteins，migration of pre-differentiated cells to the injured area，and the expression of homing-related chemokines before and after intervention with the β -catenin agonist WAY-262611

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能誘導(dǎo)hPDMSCs向心肌細(xì)胞分化，提高預(yù)分化細(xì)胞的歸巢能力，其機制與丹參酮ⅡA調(diào)控Wnt/β-catenin通路有關(guān)。