高低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞與LEC共培養(yǎng)后目標(biāo)細(xì)胞miR-92a-3p表達(dá)及其靶基因功能分析

蔣旭，劉琦，張瑩，姚茜，3，韋正波，謝瑩，3

1 廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，廣西南寧530000；2 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院；3 廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

鼻咽癌(NPC)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，在東南亞尤其是中國南方地區(qū)高發(fā)[1]。早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NPC的主要臨床特征，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是NPC患者預(yù)后不良的主要原因。因此，揭示NPC發(fā)展過程中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制具有重要的研究意義和臨床價(jià)值[2,3]。近年來，腫瘤微環(huán)境與腫瘤發(fā)生發(fā)展尤其是侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系越來越受到學(xué)者的重視。NPC起源于鼻咽上皮，由于周圍解剖結(jié)構(gòu)的特殊性，局部含有大量的淋巴組織，其中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(LEC)也是NPC局部微環(huán)境中的重要成員之一，LEC與NPC細(xì)胞的交互作用在NPC的侵襲和轉(zhuǎn)移中可能起到了非常重要的作用。

本課題組在前期的研究[4]過程中發(fā)現(xiàn)，NPC高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株5-8F的條件培養(yǎng)基明顯促進(jìn)LEC的增殖，而LEC的條件培養(yǎng)基促使5-8F細(xì)胞的侵襲遷移能力增強(qiáng)，通過兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)可以明顯促進(jìn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移，特別是直接接觸共培養(yǎng)尤為明顯。為了進(jìn)一步研究其潛在作用，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測兩種細(xì)胞在共培養(yǎng)前后轉(zhuǎn)錄組水平的表達(dá)變化，我們發(fā)現(xiàn)miRNA-17-92基因簇在共培養(yǎng)后的兩種細(xì)胞中均表達(dá)改變。miRNA-17-92基因簇是典型的高度保守的多順反子miRNA簇，位于人類13號(hào)染色體13q31.3區(qū)域C13orf25的第三個(gè)內(nèi)含子上，編碼六個(gè)成熟的miRNA，包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a[5]，miR-17-92基因簇被多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是一種強(qiáng)效的原癌基因,也是原癌miRNA的典型代表[6]。多項(xiàng)研究[7]表明，miRNA-17-92基因簇的成員在各種疾病中，尤其是在不同類型的癌癥中存在特異性表達(dá)，提示miRNA-17-92基因簇與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究顯示，miR-92a與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能是結(jié)直腸癌的潛在標(biāo)志物，而且miR-92a在膀胱癌[8]、結(jié)直腸癌[9]、肺癌[10]、宮頸癌[11]、食道鱗狀細(xì)胞癌[12]中表達(dá)增加并促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。因此，為了進(jìn)一步驗(yàn)證NPC細(xì)胞與LEC交互作用下miR-92a-3p表達(dá)的改變對NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響，我們設(shè)計(jì)了Transwell小室共培養(yǎng)體系，用不同轉(zhuǎn)移潛能的NPC細(xì)胞系與LEC進(jìn)行Transwell共培養(yǎng)，觀察miR-92a-3p在共培養(yǎng)前后細(xì)胞中表達(dá)的差異，并利用生物信息學(xué)的方法對miR-92a-3p靶基因進(jìn)行功能預(yù)測，探討其對NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在的潛在影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 人NPC高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株5-8F和人NPC低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株6-10B購自湖南湘雅中心實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫。LEC購自北京裕恒豐科技有限公司，由美國Sciencell公司構(gòu)建。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清FBS購自美國Gibco公司，ECM培養(yǎng)基套裝購自美國Sciencell公司，青鏈霉素購自中國Solarbio公司

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 5-8F細(xì)胞和6-10B細(xì)胞分別培養(yǎng)于89%DMEM+10%FBS+1%青鏈霉素培養(yǎng)基中，LEC在88%ECM+10%FBS+1%ECGS+1%青鏈霉素培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的5-8F細(xì)胞、6-10B細(xì)胞以及LEC進(jìn)行常規(guī)消化后制成單細(xì)胞懸液。

1.3 細(xì)胞分組及Transwell共培養(yǎng) 采用0.4 μm孔徑的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)，將兩種細(xì)胞分別接種于上下室，采用6孔板進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，以共培養(yǎng)后的Transwell上室細(xì)胞和6孔板培養(yǎng)的單細(xì)胞為目標(biāo)細(xì)胞。①在Transwell上室接種1×105個(gè)LEC，加入1.5 mL DMEM完全培養(yǎng)基，下室接種1×105個(gè)5-8F細(xì)胞，加入2.6 mL DMEM完全培養(yǎng)基，記為LEC+5-8F組；在Transwell上室接種1×105個(gè)LEC，加入1.5 mL DMEM完全培養(yǎng)基，下室接種1×105個(gè)6-10B細(xì)胞，加入2.6 mL DMEM完全培養(yǎng)基，記為LEC+6-10B組；在6孔板中接種2×105個(gè)LEC，并加入4.1 mL DMEM完全培養(yǎng)基，記為LEC組。②在Transwell上室接種1×105個(gè)5-8F細(xì)胞，加入1.5 mL DMEM完全培養(yǎng)基，下室接種1×105個(gè)LEC，加入2.6 mL DMEM完全培養(yǎng)基，記為5-8F+LEC組；在6孔板中接種2×105個(gè)5-8F細(xì)胞，并加入4.1 mL DMEM完全培養(yǎng)基，記為5-8F組。③在Transwell上室接種1×105個(gè)6-10B細(xì)胞，加入1.5 mL DMEM完全培養(yǎng)基，下室接種1×105個(gè)LEC，加入2.6 mL DMEM完全培養(yǎng)基，記為6-10B+LEC組；在6孔板中接種2×105個(gè)6-10B細(xì)胞，并加入4.1 mL完全培養(yǎng)基，記為6-10B組。

1.4 各組目標(biāo)細(xì)胞中miR-92a-3p檢測 采用qRT-PCR法。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)，使用miRNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板、以U6為內(nèi)參，進(jìn)行Realtime-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30s，40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中miR-92a-3p的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 miR-92a-3p靶基因預(yù)測及KEGG通路分析 通過4個(gè)miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站miRDB(http://mirdb.org/)、miRTarbase(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu)、miRWalk(http://129.206.7.150/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測miR-92a-3p的靶基因，在Venny2.1.0網(wǎng)站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)取靶基因的交集，即為miR-92a-3p的靶基因。使用KOBAS3.0在線網(wǎng)站(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)對4個(gè)靶基因預(yù)測網(wǎng)站所共同預(yù)測的靶基因進(jìn)行KEGG通路分析，選取P<0.05的通路用RStudio軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 各組目標(biāo)細(xì)胞中miR-92a-3p的相對表達(dá)量比較 LEC+5-8F組、LEC+6-10B組、LEC組細(xì)胞中miR-92a-3p的相對表達(dá)量分別為605.00±119.00、46.30±11.40、1.01±0.16，組間相比，P均<0.05。5-8F+LEC組、5-8F組細(xì)胞中miR-92a-3p的相對表達(dá)量分別為212.00±39.40、1.00±0.08，組間相比，P<0.05。6-10B+LEC組、6-10B組細(xì)胞中miR-92a-3p的相對表達(dá)量分別為4.14±0.87、1.02±0.24，組間相比，P<0.05。

2.2 miR-92a-3p的靶基因預(yù)測結(jié)果 miR-92a-3p的靶基因預(yù)測結(jié)果見圖1。由圖1可知，有74個(gè)基因被4個(gè)miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站共同預(yù)測為miR-92a-3p的靶基因，分別是FNIP1、SLC12A5、PTAR1、ZFC3H1、KLHL14、GOLGA3、CPEB3、SLC25A32、SGK3、ZFYVE21、ERGIC2、TECPR2、TRIM36、SYNJ1、RSBN1、ITPR1、MAP1B、PITPNA、ZDHHC5、TMF1、TEF、MOAP1、FAM20C、SOX11、DENND4B、TOB2、PDZD8、GOLGA4、LMBR1L、EVI5、BCAT2、DUSP10、RPL15、TULP4、TNPO1、FAM135A、RORA、YIPF4、PEAK1、WASL、NFYB、TRIO、SLC9A1、DMXL1、PIK3AP1、KLHL11、ATP7A、XYLT2、PER2、ARPC2、BMPR2、MYH9、NUFIP2、SETD5、TSC1、ATP2B4、GALNT7、PDS5B、DBT、IKZF2、SKI、WDR81、NFIB、SMAD7、DNAJC27、ATXN7、EIF4G2、NFATC2IP、TRAM2、UVRAG、AURKA、CREB3L2、GAA、ARFGEF2。

圖1 miR-92a-3p的靶基因預(yù)測結(jié)果

2.3 miR-92a-3p靶基因功能分析結(jié)果 miR-92a-3p靶基因KEGG通路分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，miR-92a-3p的靶基因富集在TGFβ、PI3k/Akt、AMPK、mToR以及鈣信號(hào)通路等與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的通路上。

3 討論

自從1889年Stephen Paget[13]提出腫瘤的“種子-土壤”學(xué)說以來，腫瘤微環(huán)境與腫瘤發(fā)生發(fā)展特別是轉(zhuǎn)移的關(guān)系越來越受到學(xué)者們的重視。部分研究也表明腫瘤細(xì)胞會(huì)通過調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)移前微環(huán)境以達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，而且不同類型的腫瘤具有不同器官或組織的轉(zhuǎn)移偏好，如中國南部地區(qū)高發(fā)的NPC早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移就是其主要臨床特征。NPC發(fā)生于患者的鼻咽腔內(nèi)，其周圍微環(huán)境中存在著大量的淋巴樣組織及淋巴管組織，淋巴管的密度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示LEC與NPC的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。LEC在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中也起到了極其重要的作用，Pekkonen等[14]將人類黑色素瘤細(xì)胞暴露于LEC后使癌細(xì)胞更具侵襲性，這些癌細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)后，更容易發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。本課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)NPC細(xì)胞與LEC的交互作用明顯促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移，將5-8F細(xì)胞與LEC混合后接種，可以使移植瘤小鼠更快的發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示NPC細(xì)胞與LEC的交互作用在NPC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起到了很重要的作用。

圖2 miR-92a-3p靶基因KEGG通路分析結(jié)果

miRNA是一類小的非編碼RNA，可以調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展，尤其是侵襲和轉(zhuǎn)移的過程。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜而低效的過程。為了在遠(yuǎn)離最初的原發(fā)腫瘤部位形成轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞需要通過基底膜侵入、滲入血流，通過循環(huán)傳播，滲透到遠(yuǎn)端組織或者器官，并適應(yīng)新的生存和增殖的場所[15]。在每個(gè)步驟中，腫瘤細(xì)胞與其周圍的微環(huán)境發(fā)生緊密的相互作用。事實(shí)上，現(xiàn)在普遍認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能是由其內(nèi)在和外在的關(guān)系決定的，而miRNA的作用與調(diào)節(jié)兩者促進(jìn)轉(zhuǎn)移相關(guān)[16]，miRNA可以通過改變癌細(xì)胞的內(nèi)在特性，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等，參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程。同時(shí)，miRNA也可以參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程中不同微環(huán)境的形成，通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來調(diào)節(jié)腫瘤的轉(zhuǎn)移。miR-92a-3p是miR-17-92基因簇的主要成員之一。有研究[12]表明，miR-92a-3p與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)，且是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，如miR-92a前體的轉(zhuǎn)染可以使人食管癌細(xì)胞系KYSE410的侵襲和遷移能力增強(qiáng)。miR-92a在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，尤其是發(fā)生轉(zhuǎn)移的組織中上調(diào)更為明顯[17]。miR-92a也可以作為結(jié)直腸癌的早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移標(biāo)志物，Jepsen[18]選擇T1期伴有(N+)或無(N0)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者配對進(jìn)行miRNA檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-17-3p和miR-92a-3p在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的樣本中明顯高表達(dá)。為了進(jìn)一步研究miR-92a-3p在NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中潛在作用，本實(shí)驗(yàn)選擇用兩種不同轉(zhuǎn)移潛能的NPC細(xì)胞5-8F(高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)和6-10B(低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)分別與LEC共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種NPC細(xì)胞均可以刺激LEC內(nèi)miR-92a-3p的表達(dá)上調(diào)，而高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株5-8F的刺激能力明顯強(qiáng)于低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移細(xì)胞株6-10B，我們推測具有不同轉(zhuǎn)移潛能的NPC細(xì)胞與LEC共培養(yǎng)后合成miR-92a-3p的能力不同可能與兩種細(xì)胞不同的轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)，具有不同轉(zhuǎn)移潛能的NPC細(xì)胞可以在腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)miR-92a-3p的表達(dá)，從而促進(jìn)NPC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

隨后，為了進(jìn)一步分析miR-92a-3p的作用靶點(diǎn)，本研究分別通過miRDB、miRTarbase、miRWalk、TargetScan四大在線工具預(yù)測hsa-miR-92a-3p靶基因。這些數(shù)據(jù)庫彼此之間的算法都各不相同，采用不同的數(shù)據(jù)庫同時(shí)對目的miRNA進(jìn)行預(yù)測，做交集處理，可得到相對可靠的miRNA靶基因。對這些靶基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，這些靶基因富集在TGFβ、PI3k/Akt、AMPK、mToR以及鈣信號(hào)通路等與腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)的通路上。綜合文獻(xiàn)分析，Rao等[19]也證實(shí)miR-92a可以靶向亮氨酸重復(fù)蛋白磷酸酶(PHLPP2)，從而激活PI3K/Akt/mTOR途徑，協(xié)助T細(xì)胞淋巴瘤(MCL)抵抗化療誘導(dǎo)的凋亡；而下調(diào)miR-92a的表達(dá)可以抑制MCL移植瘤小鼠模型中腫瘤的生長。在心血管系統(tǒng)的研究方面發(fā)現(xiàn)，miR-92a還參與了內(nèi)皮細(xì)胞損傷、動(dòng)脈粥樣硬化等過程，在氧化應(yīng)激的狀態(tài)下膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白SREBP2和miR-92a表達(dá)上調(diào)，或者通過靶向去乙酰化酶(SIRT1)、Kruppel樣因子KLF2和KLF4導(dǎo)致NOD樣受體家族熱蛋白結(jié)合域3炎癥因子激活和內(nèi)源性NO合成酶抑制，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂[20]。以上研究都提示miR-92a-3p可能參與到腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為過程中，并對腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)起到了極其重要的作用，通過對預(yù)測靶點(diǎn)的深入研究將對進(jìn)一步闡明NPC細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制提供幫助。

總之，我們發(fā)現(xiàn)不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的NPC細(xì)胞系與LEC共培養(yǎng)后細(xì)胞內(nèi)miR-92a-3p表達(dá)升高，不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能的NPC細(xì)胞系與LEC共培養(yǎng)后細(xì)胞內(nèi)miR-92a-3p的表達(dá)水平與兩種NPC細(xì)胞不同的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)，提示miR-92a-3p可能是NPC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物。通過4個(gè)在線miRNA靶基因預(yù)測網(wǎng)站找到了相對可靠的miR-92a-3p的靶基因,為后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-92a-3p在NPC腫瘤微環(huán)境中調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，從而影響NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供了數(shù)據(jù)與理論支持。