通竅活血湯灌胃對小鼠顱腦損傷的改善作用及其機制

杜勇，王革生，張淑敏，馬濤，張少輝，宋光榮，劉曉漢，周玉嘉

1 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078；2 民航總醫(yī)院；3 北京中醫(yī)藥大學

創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是臨床上的常見疾病，是創(chuàng)傷患者死亡和致殘的主要原因[1～3]。TBI治療難度大、治療費用高，具有高致殘率、高致死率的特點，給個人、家庭以及社會在經(jīng)濟、精神上都帶來了巨大的負擔[1, 4, 5]。因此，為該疾病尋找新的治療手段和方法，找到高效的治療藥物具有重要臨床和社會意義。由于TBI的原發(fā)性損傷無法逆轉(zhuǎn)，因此，控制TBI繼發(fā)性損傷至關(guān)重要。腦損傷后神經(jīng)元丟失是導致繼發(fā)性損傷的主要原因，壞死和凋亡被認為是神經(jīng)元損傷的主要形式[6, 7]。壞死發(fā)生在損傷即刻，凋亡則具有一定的緩沖期限，提示凋亡可以作為治療干預(yù)的生物學過程。自噬和凋亡之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，研究[8]顯示，TBI能導致細胞自噬功能障礙，從而介導細胞死亡。藥物激活自噬可以抑制細胞凋亡，提示自噬是一個非常好的藥物作用靶點。細胞自噬包括大自噬、微自噬、核糖體自噬、聚集體自噬和線粒體自噬等多種亞型，其中線粒體自噬與疾病的關(guān)系是目前的研究熱點之一[9, 10]。線粒體是細胞的能量工廠，對于細胞維持正常生理代謝發(fā)揮著重要的作用。研究[11]顯示，TBI會促發(fā)線粒體功能紊亂，腦損傷后1～3 h即發(fā)生線粒體損傷，線粒體損傷和細胞存活、功能修復(fù)密切相關(guān)。線粒體自噬是一種選擇性清除受損線粒體的自噬過程，可以保護細胞免受損傷線粒體或者促凋亡因子的損害[12]。2018年8月10日～2019年6月25日，本研究觀察了通竅活血湯灌胃對小鼠顱腦損傷的改善作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 小鼠分組、顱腦損傷模型的建立及通竅活血湯的給予方法 60只小鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和治療組，每組20只。模型組和治療組小鼠稱重后用4%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉，頭部剪毛消毒，于頭皮正中切開，切口長2 cm，剝離右側(cè)顱頂骨膜，固定于小鼠腦立體定位儀上，用顱骨鉆刺一小孔，在左側(cè)頂骨處鉆一直徑4 mm的骨窗，暴露硬腦膜并使其完整，采用改良自由落體法，使用40 g砝碼從高20 cm處墜落撞擊于硬腦膜表面的圓柱體，建立顱腦損傷模型，逐層消毒、縫合頭皮后回籠飼養(yǎng)；假手術(shù)組麻醉后暴露骨窗，不擊打腦皮質(zhì)，縫合頭皮后回籠飼養(yǎng)。各組小鼠建模后6 h開始給藥，三組均給予凝血酶、甘露醇尾靜脈注射，治療組同時給予通竅活血湯顆粒劑(17.2 g/kg)灌胃。

1.2 各組小鼠神經(jīng)功能損傷程度評估 各組小鼠建模后24 h時，使用改良的神經(jīng)功能缺損評分(mNSS評分)評估神經(jīng)功能損傷程度。mNSS評分主要包括提尾反射、行走測試、感覺測試、平衡測試、反射缺失和反常運動，總分18分，缺少一項反射或動物不能完成一項任務(wù)加1 分。

1.3 各組小鼠腦組織水含量測定 每組小鼠在神經(jīng)功能損傷程度觀察完畢后，各取3只處死，開顱去掉嗅球、小腦，取大腦損傷側(cè)的腦組織，用濾紙吸盡表面血漬，置于已烤干并稱重的錫紙上，用萬分之一電子天平稱濕重后，置入電熱恒溫干烘箱中，110 ℃下烘烤24～48 h至恒重，兩次稱重誤差小于0.1 mg后，得其干重，參照Ellion公式計算小鼠腦組織水含量。小鼠腦組織水含量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4 各組小鼠腦組織細胞凋亡率測算 每組小鼠在神經(jīng)功能損傷程度觀察完畢后，各取3只處死，取大腦損傷側(cè)的腦組織，在恒冷冰凍切片機內(nèi)切片，再用冷丙酮在4 ℃固定10～20 min，PBS洗滌2次，滴加蛋白酶K工作液(20 μg/mL)，20～37 ℃反應(yīng)15～30 min，PBS洗滌3次，加入50 μL TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌3次，滴加DAPI避光孵育5 min，PBS洗滌4次，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，計算綠色熒光細胞占總細胞的百分比，即為細胞凋亡率。

1.5 各組小鼠腦組織線粒體DNA(mtDNA)檢測 采用PCR法。取各組小鼠腦組織，勻漿后在4 ℃條件下800×g離心5 min，取上清液0.5 mL加入含0.5 mL線粒體蛋白抽提試劑盒溶液A的離心管中，4 ℃條件下15 000×g離心10 min，離心后的沉淀即為線粒體。往沉淀中加入0.2 mL漂洗液重懸線粒體，4 ℃條件下15 000×g離心10 min，棄上清，每20 μL線粒體加入200 μL含有磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和PMSF的冷裂解液，置于4 ℃搖床平臺上溫和振蕩15 min，4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min，上清液即為線粒體蛋白提取物。取線粒體蛋白提取物，采用SYBR Green法進行PCR擴增，引物序列如下：mtDNA正向引物為5′-CAGCCGCTATTAAAGGTTCG-3′，反向引物為5′-AGAGTGCGTCATATGTTGTTC-3′；β-Actin正向引物為5′-GTGTTCTGTTTCTCCTGGCA-3′,反向引物為5′-GGCATCCACGAAACTACCTT-3′。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示細胞中mtDNA的相對表達量。

1.6 各組小鼠腦組織中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62及錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、細胞色素C氧化酶Ⅳ亞型(COX Ⅳ)、切割活化的半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3)、凋亡抑制基因Bcl-2蛋白檢測 采用Western Blotting法。取各組小鼠腦組織置于勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎，加含PMSF單去污劑裂解液于勻漿器中進行勻漿，裂解30 min后移至離心管中，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min，取上清與5倍蛋白上樣緩沖液混合后，放入沸水中變性10 min，冷卻至室溫，120 V恒壓凝膠電泳后進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用含5%脫脂奶粉的TBST浸泡，室溫搖床封閉2 h，加入相應(yīng)一抗，4 ℃孵育過夜，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，加入HRP標記的相應(yīng)二抗，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片，運用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。獲得LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ蛋白相對表達量后，計算LC3 Ⅱ/Ⅰ。LC3 Ⅱ/Ⅰ=LC3-Ⅱ蛋白相對表達量/LC3-Ⅰ蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠神經(jīng)功能損傷程度比較 假手術(shù)組、模型組、治療組mNSS評分分別為(2.00±0.47)、(15.00±0.47)、(6.00±0.94)分，組間相比，P均<0.05，提示通竅活血湯有效地緩解了小鼠神經(jīng)功能損傷情況。

2.2 各組小鼠腦組織水含量比較 假手術(shù)組、模型組、治療組腦組織水含量分別為74.4%±0.36%、84.2%±0.64%和79.5%±0.70%，組間相比，P均<0.05，提示通竅活血湯有效降低了小鼠腦組織水含量。

2.3 各組小鼠腦組織細胞凋亡率比較 假手術(shù)組、模型組、治療組細胞凋亡率分別為9.60%±1.87%、35.70%±6.61%和21.50%±5.19%，組間相比，P均<0.05，提示通竅活血湯可降低小鼠腦組織細胞凋亡率。

2.4 各組小鼠腦組織mtDNA相對表達量比較 假手術(shù)組、模型組、治療組腦組織mtDNA相對表達量分別為1.028±0.233、0.040±0.003和0.510±0.201，組間相比，P均<0.05，提示通竅活血湯可以緩解由腦損傷所導致的mtDNA相對表達量減少。

2.5 各組小鼠腦組織中LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62、MnSOD、COX Ⅳ、cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達量比較 各組小鼠腦組織中LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62、MnSOD、COX Ⅳ、cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達量比較見表1。由表1可知，與假手術(shù)組相比，模型組和治療組LC3 Ⅱ/Ⅰ、MnSOD、COX Ⅳ、Bcl-2蛋白相對表達量均顯著降低，p62、cleaved Caspase-3蛋白相對表達量均顯著升高；與模型組相比，治療組LC3 Ⅱ/Ⅰ、MnSOD、COX Ⅳ、Bcl-2蛋白相對表達量均顯著升高，p62、cleaved Caspase-3蛋白相對表達量均顯著降低。

表1 各組小鼠腦組織中LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62、MnSOD、COX Ⅳ、cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達量比較

注：與假手術(shù)組相比，＊P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

3 討論

TBI是臨床常見疾病，多由事故災(zāi)害以及運動損傷導致患者腦細胞神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)的損傷[9]，可造成外界適應(yīng)能力、感知能力和認知能力不同程度的降低，但其作用機制尚不清楚。 有研究[13,14]認為，通竅活血湯中的多種有效成分均起到了減輕顱腦損傷的作用，對腦損傷動物表現(xiàn)出保護作用，如川穹、紅花和桃仁可以改善血液流變，麝香具有解毒活血以及開通諸竅的功能。本研究對通竅活血湯治療TBI的機制進行了探討，揭示了通竅活血湯在改善腦水腫等方面的作用及機制，為通竅活血湯臨床治療TBI提供更多的實驗及理論依據(jù)。

mNSS評分從反射、平衡、感覺以及運動等幾個方面評判小鼠神經(jīng)功能損傷程度，小鼠的mNSS評分越高說明神經(jīng)功能損傷程度越嚴重。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠較假手術(shù)組的mNSS評分顯著升高，經(jīng)過通竅活血湯治療后mNSS評分顯著降低，說明通竅活血湯可以使小鼠的神經(jīng)功能損傷程度得到有效地改善。我們還檢測了小鼠的腦水腫情況，通過通竅活血湯治療后小鼠的腦組織水含量顯著降低，提示通竅活血湯對顱腦損傷的治療具有顯著影響。

近年來研究[13,14]表明，通竅活血湯對多種疾病的治療作用可能是通過激活線粒體自噬，從而介導疾病的發(fā)生發(fā)展。然而通竅活血湯對顱腦損傷的治療作用是否與線粒體自噬密切關(guān)聯(lián)目前尚未見報道。但已有研究[15,16]表明，褪黑激素通過mTOR途徑激活線粒體自噬，減輕腦損傷炎癥，改善神經(jīng)元死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯治療的小鼠能夠促進LC3-Ⅰ型向LC3-Ⅱ型的轉(zhuǎn)換。自噬激活后，LC3-Ⅱ形成并位于自噬體膜的表面，是特異性表達于自噬體的分子標志蛋白，用于檢測自噬水平，LC3 Ⅱ/Ⅰ的升高也提示了通竅活血湯可以促進細胞自噬的發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯緩解了由于顱腦損傷所導致的p62蛋白的表達升高。p62蛋白參與信號轉(zhuǎn)導、自噬與蛋白降解以及線粒體自噬，說明通竅活血湯可能通過提高p62蛋白的表達從而提高細胞自噬水平。

線粒體參與細胞內(nèi)的能量供給，是細胞內(nèi)重要的細胞器[17]。線粒體自噬是通過自噬清除細胞內(nèi)受損線粒體。我們發(fā)現(xiàn)，通竅活血湯治療后的小鼠腦組織中的MnSOD和COX Ⅳ的表達均呈現(xiàn)上升趨勢，提示我們通竅活血湯可能促進了線粒體自噬的發(fā)生。研究[6,12]顯示，自噬可以保護細胞免于受到外界刺激后引起的細胞凋亡，提示細胞自噬可以促進細胞的存活。本研究結(jié)果顯示，通竅活血湯能夠有效緩解由顱腦損傷導致的Bcl-2表達的下降和cleaved Caspase-3表達的上升，提示通竅活血湯通過激活線粒體自噬從而抑制細胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，通竅活血湯灌胃可改善小鼠顱腦損傷情況，其作用機制可能與激活線粒體自噬、抑制細胞凋亡有關(guān)。本研究揭示了通竅活血湯改善顱腦損傷的機制作用，可以為顱腦損傷的臨床治療提供新的實驗支持和理論依據(jù)。