臨床罕見的類孟買血型檢測鑒定(附1例報(bào)告)

潘英芳，徐群，孫昌魁，宋永紅，李京，呂紅娟，周娜，喬文本

山東省血液中心，濟(jì)南250014

人類血型抗原的編碼表達(dá)在遺傳過程中受多種因素調(diào)控，不同程度的突變誘發(fā)各種血型變異體及罕見稀有血型的形成。在已發(fā)現(xiàn)的39個(gè)人類血型系統(tǒng)中，ABO血型系統(tǒng)在臨床輸血中最為重要，現(xiàn)行的臨床輸血技術(shù)規(guī)范，也早已明確規(guī)定受血者及供血者的ABO血型為輸血必檢項(xiàng)目[1,2]。ABO血型鑒定一般采用ABO血型正反定型實(shí)驗(yàn)。正定型，又稱細(xì)胞定型，是指采用定型試劑和被檢細(xì)胞反應(yīng)所鑒定出的ABO血型；反定型，又稱血清定型，是指用被檢者血清和已知ABO血型的試劑紅細(xì)胞進(jìn)行的反應(yīng)所鑒定出的ABO血型。兩實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀一致，方可準(zhǔn)確定義A、B、O或AB血型，若兩實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符則稱ABO血型正反定不符，?？紤]ABO亞型、罕見稀有血型、室溫性不規(guī)則抗體干擾或疾病等因素所致。2019年6月，我們發(fā)現(xiàn)1例獻(xiàn)血者外周血樣本的ABO血型正反定型結(jié)果不符，血型鑒定困難，隨即對(duì)其進(jìn)行基因測序，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 外周血樣本及試劑 山東省血液中心檢驗(yàn)科送檢的獻(xiàn)血者外周血樣本5 mL，初檢獻(xiàn)血者ABO血型正定型反應(yīng)表現(xiàn)為O型，反定型反應(yīng)表現(xiàn)為A型，ABO血型正反定不符，血型鑒定困難。單克隆抗-A抗體、單克隆抗-B抗體，Ac、Bc、Oc試劑紅細(xì)胞購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，抗人球蛋白試劑、血型不規(guī)則抗體篩選細(xì)胞、血型不規(guī)則抗體鑒定譜細(xì)胞、抗-H抗體、抗-Lea抗體、抗-Leb抗體試劑購自荷蘭Sanquin公司。

1.2 血型免疫血清學(xué)檢測方法

1.2.1 ABO血型鑒定 包括正定型和反定型。①正定型：取潔凈小試管2支，分別標(biāo)明抗A、抗B，用滴管分別加入抗A、抗B血清2滴于試管底部，再以滴管分別加入獻(xiàn)血者3%～5%的紅細(xì)胞鹽水懸液1滴混勻，以1 000 r/min離心15 s，觀察并判讀結(jié)果。②反定型：取潔凈小試管3支，分別標(biāo)明A、B和O型細(xì)胞，用滴管分別加入獻(xiàn)血者3%～5%的紅細(xì)胞鹽水懸液2滴于試管底部，再以滴管分別加入A、B和O型3%～5%試劑紅細(xì)胞懸液1滴混勻，以1 000 r/min離心15 s，觀察并判讀結(jié)果。

1.2.2 紅細(xì)胞H抗原、Lea抗原、Leb抗原鑒定 取3支潔凈試管，分別標(biāo)注抗-H、抗-Lea、抗-Leb，各管分別加入相應(yīng)的抗血清試劑1滴和獻(xiàn)血者3%～5%紅細(xì)胞懸液50 μL，3 000 r/min離心15 s，觀察并判讀結(jié)果。

1.2.3 紅細(xì)胞弱A抗原、弱B抗原、弱H抗原檢測 用生理鹽水洗滌1 mL獻(xiàn)血者紅細(xì)胞和1 mL O型獻(xiàn)血者紅細(xì)胞3次，移除上清液，分別加入1 mL抗-A抗體試劑、抗-B抗體試劑、抗-H抗體試劑，充分混勻紅細(xì)胞和抗血清，4 ℃孵育過夜，離心后移除上層抗血清，將紅細(xì)胞轉(zhuǎn)入干凈試管，用4 ℃預(yù)冷生理鹽水洗滌紅細(xì)胞6次，留取壓積紅細(xì)胞，加入同等量的生理鹽水56 ℃熱放散，離心后分離所得的上清液即為放散液。取干凈試管，分別加入放散液2滴和1滴試劑Ac細(xì)胞、試劑Bc細(xì)胞、試劑Oc細(xì)胞，離心后觀察并判讀結(jié)果。

1.2.4 不規(guī)則抗體篩查和鑒定 取潔凈小試管，分別標(biāo)注Oc1、Oc2、Oc3，加入Oc1、Oc2、Oc3試劑細(xì)胞各1滴，再以滴管分別加入獻(xiàn)血者血清各2滴，以1 000 r/min離心15 s，觀察并記錄結(jié)果；將上述試管置于4 ℃冰箱中，靜置10 min后再次離心，觀察并記錄結(jié)果；再將試管置于37 ℃水浴30 min，取出離心后觀察并判讀結(jié)果；然后洗滌細(xì)胞3次，滴加2滴抗人球蛋白試劑，離心后觀察并記錄結(jié)果。

1.3 基因測序 使用TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒提取獻(xiàn)血者血液基因組DNA，測定其濃度和純度后，送天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司鑒定其ABO血型基因型并對(duì)FUT1基因進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 血型免疫血清學(xué)檢測結(jié)果 ABO血型鑒定結(jié)果顯示，獻(xiàn)血者ABO血型正定型反應(yīng)表現(xiàn)為O型，反定型反應(yīng)表現(xiàn)為A型，正反定型結(jié)果不符。紅細(xì)胞H抗原、Lea抗原、Leb抗原鑒定結(jié)果顯示，獻(xiàn)血者紅細(xì)胞上未檢測到H抗原，Lea抗原陰性、Leb抗原陽性，Lewis血型系統(tǒng)定型為Le(a-b+)，初步考慮該獻(xiàn)血者血型為孟買血型。紅細(xì)胞弱A抗原、弱B抗原、弱H抗原檢測結(jié)果顯示，獻(xiàn)血者紅細(xì)胞僅吸收放散出抗-A抗體，推斷該獻(xiàn)血者血型可能為A型類孟買血型。不規(guī)則抗體篩查和鑒定結(jié)果顯示，在4 ℃與室溫條件下，鹽水介質(zhì)中不規(guī)則抗體反應(yīng)均呈陽性；在37 ℃條件下，鹽水介質(zhì)及抗人球蛋白介質(zhì)均呈陰性，推斷該不規(guī)則抗體為室溫性抗H抗體。

2.2 基因測序結(jié)果 獻(xiàn)血者ABO血型基因型為AA型。FUT1基因測序結(jié)果見圖1。由圖1可知，F(xiàn)UT1基因第四外顯子第658位點(diǎn)發(fā)生了C堿基突變?yōu)門堿基的改變，即c.658 C>T，且該突變?yōu)榧兒贤蛔儯袛喃I(xiàn)血者血型為A型類孟買血型。

圖1 FUT1基因測序結(jié)果

3 討論

血型是由特異性同種抗體檢測的紅細(xì)胞表面的遺傳特性表現(xiàn)[3]，正確的血型鑒定是保證臨床安全用血的關(guān)鍵，由于ABO血型抗原的強(qiáng)度是所有人類血型系統(tǒng)抗原中免疫原性最強(qiáng)的，且A、B、O血型個(gè)體體內(nèi)存在相應(yīng)的抗-A和(或)抗-B抗體，一旦ABO血型鑒定不準(zhǔn)確造成ABO錯(cuò)誤輸血，誘發(fā)體內(nèi)抗原抗體凝集反應(yīng)即可發(fā)生急性或速發(fā)型溶血性輸血反應(yīng)，受血者可出現(xiàn)不同程度的寒戰(zhàn)、高熱、輸注無效甚至休克，嚴(yán)重者可危及生命，因此準(zhǔn)確的ABO血型定型格外重要，是保證安全有效輸血的前提。在臨床實(shí)踐中，我們經(jīng)常碰見血型鑒定困難的案例，干擾ABO血型鑒定的因素主要?dú)w類為：正反定不符、弱抗原的存在、不同試劑鑒定結(jié)果難以統(tǒng)一、不規(guī)則抗體的存在等。本研究案例綜合了正反定不符和弱抗原存在兩大難點(diǎn)，我們借助于免疫血清學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)準(zhǔn)確判定該獻(xiàn)血者血型為A型類孟買血型。美國輸血協(xié)會(huì)定義稀有血型是指該血型在人群中的概率為1/1 000，而血型在人群中概率低于1/5 000則稱為罕見血型。參照研究統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[4]，歐洲人孟買血型、類孟買血型的概率為1/1 000 000，日本人概率為1/15 000，印度人概率為1/10 000，在我國鮮有報(bào)道，因此孟買血型及類孟買血型是極為罕見的稀有血型。

1952年，Bhende在印度孟買發(fā)現(xiàn)一例H基因缺陷型血型，血清學(xué)表現(xiàn)為紅細(xì)胞表面未檢測到A、B、H抗原，同時(shí)血清中存在抗-A、抗-B、抗-H抗體，最終將其命名為孟買血型。這是孟買血型首次被發(fā)現(xiàn)。1961年，有專家發(fā)現(xiàn)1例與孟買血型相似，但紅細(xì)胞上存在少許A抗原且唾液中可檢測到微量H抗原的血型,該血型被定義為類孟買血型[5～7]。針對(duì)本例獻(xiàn)血者，免疫血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅細(xì)胞表面未檢測到A、B、H抗原，血清中存在不規(guī)則抗體，經(jīng)鑒定為抗H抗體，因此我們初步考慮該獻(xiàn)血者為類孟買血型，同時(shí)借助于紅細(xì)胞吸收放散實(shí)驗(yàn)，檢測出較弱的A抗原表達(dá)，因此推論該獻(xiàn)血者為A型類孟買血型，這也是山東省在獻(xiàn)血者群體中首次發(fā)現(xiàn)類孟買血型。

隨著研究的不斷深入，孟買血型、類孟買血型抗原合成、分泌、表達(dá)等一些分子機(jī)制也逐漸被揭開[8,9]。調(diào)控H抗原編碼表達(dá)的基因?qū)賻r藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FUT)家族，其中FUT1、FUT2、FUT3三個(gè)基因參與ABH抗原物質(zhì)的表達(dá)。FUT1和FUT2基因有較高的同源性，均位于19q13.33，F(xiàn)UT1基因決定細(xì)胞膜上H抗原的表達(dá)，F(xiàn)UT2基因決定分泌液中H抗原的表達(dá)，而FUT2和FUT3兩個(gè)基因協(xié)同決定Lewis抗原的產(chǎn)生[10，11]。H基因變異存在遺傳異質(zhì)性和基因多態(tài)性，當(dāng)FUT1及FUT2基因發(fā)生突變時(shí)，可致紅細(xì)胞膜上和分泌物中均缺乏ABH抗原，此時(shí)該血型為孟買血型；當(dāng)FUT1基因突變失活、FUT2基因正常，可致紅細(xì)胞膜上ABH抗原缺失，分泌物中尚存在ABH抗原，此時(shí)該血型為類孟買血型。目前發(fā)現(xiàn)的FUT1突變有60多種，在中國人群中，F(xiàn)UT1基因比較常見的突變種類主要是547-552delAG(即h1型)、880-882delTT(即h2型)，以及近幾年發(fā)現(xiàn)的658 C>T(即h3型)和35C-T(h4型)[12,13]?？紤]到免疫血清學(xué)在疑難血型鑒定中存在一定的局限性，我們對(duì)該獻(xiàn)血者紅細(xì)胞FUT1基因進(jìn)行了檢測，獻(xiàn)血者基因測序結(jié)果顯示，F(xiàn)UT1基因的658位點(diǎn)C堿基突變?yōu)門堿基，符合h3型突變。

研究[14]顯示，在FUT2和FUT3基因互相作用下，類孟買血型的紅細(xì)胞Lewis血型往往表現(xiàn)為Le(a-b+)或者Le(a-b-)。本研究中，我們也對(duì)該獻(xiàn)血者紅細(xì)胞Lewis抗原表型進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示該獻(xiàn)血者紅細(xì)胞Lewis表型為Le(a-b+),符合類孟買血型Lewis血型系統(tǒng)表現(xiàn)型。

臨床實(shí)踐中，常規(guī)的血清學(xué)ABO血型初篩定型時(shí)，類孟買血型樣本正定型反應(yīng)往往表現(xiàn)為紅細(xì)胞抗原與抗-A/抗-B試劑反應(yīng)無凝集，而反定型試驗(yàn)血清中一般可以檢測到稍弱的抗-A抗體和(或)抗-B抗體，因此，類孟買血型在ABO血型初篩過程中經(jīng)常被錯(cuò)誤的定型為O型。而由于該獻(xiàn)血者血清中存在弱抗-H抗體，當(dāng)該獻(xiàn)血者作為受血者輸入普通O型紅細(xì)胞時(shí)，可能發(fā)生急性輸血反應(yīng)。而作為獻(xiàn)血者，該獻(xiàn)血者的紅細(xì)胞及血清一旦輸入O型受血者體內(nèi)，同樣會(huì)發(fā)生不可預(yù)測的輸血反應(yīng)[15～17]。因此，針對(duì)本例罕見稀有血型獻(xiàn)血者紅細(xì)胞，我們建議將獻(xiàn)血者紅細(xì)胞冰凍保存，一旦同類血型緊急用血時(shí)，可以解凍該紅細(xì)胞，同時(shí)我們也聯(lián)系家屬，建議其親屬也進(jìn)行血型檢測，有助于緊急情況下的互助使用。另外，在獻(xiàn)血者知情同意的基礎(chǔ)上，我們也將其信息編入山東省血液中心臨床輸血稀有血型庫以備不時(shí)之需。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)1例臨床罕見的A型類孟買血型；對(duì)臨床鑒定困難且懷疑為罕見類孟買血型的血液樣本，在免疫血清學(xué)方法鑒定不能明確的情況下，可進(jìn)行基因檢測明確其血型，指導(dǎo)臨床用血。隨著醫(yī)療手段的不斷更新，針對(duì)疑難血型，借助于常規(guī)免疫血清學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的同時(shí)，必要時(shí)需融入基因檢測技術(shù)[18]；另一方面，由于電子配血的跟進(jìn),人類稀有血型庫的建設(shè)也迫在眉睫。本例類孟買血型獻(xiàn)血者的發(fā)現(xiàn)，豐富了山東稀有血型庫的多樣性[19]。我們呼吁全國血液儲(chǔ)備單位，建立互聯(lián)網(wǎng)稀有血型信息分享機(jī)制，包括成立類似RhD陰性稀有血型聯(lián)盟、組建罕見稀有血型微信群，關(guān)鍵時(shí)刻實(shí)現(xiàn)無償互助獻(xiàn)血，以便解決稀有血型用血困難的問題。