堿提紅花蜂花粉多糖對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠的影響

史天潔，李淑芳，左紹遠(yuǎn),2

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000，2.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 671000）

蜂花粉(bee pollen)系蜜蜂從蜜源植物雄性花蕊內(nèi)采集的花粉粒，采集過(guò)程中，工蜂將口腔分泌物、花蜜濕潤(rùn)花粉后，將花粉粒加工而成的扁圓形狀蜂花粉顆粒。蜂花粉是傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)食品，具有多種生物學(xué)活性和藥理作用[1]。多糖是蜂花粉的主要活性成分之一，研究表明，不同來(lái)源的蜂花粉多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種生物學(xué)活性[2]。我們前期研究表明，水提紅花蜂花粉多糖的不同組分具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等作用[3-4]。多糖的結(jié)構(gòu)與其活性密切相關(guān)，而不同提取方法其結(jié)構(gòu)與活性有較大的差異[5]。為進(jìn)一步觀察紅花蜂花粉多糖的生物學(xué)活性，我們對(duì)稀堿提取的紅花蜂花粉多糖對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠的抗氧化作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要試劑

超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。D-半乳糖，上海國(guó)藥試劑集團(tuán)。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。紅花蜂花粉，云南滇峰蜂業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品（批號(hào)：20170516）

1.2 主要儀器

RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞?wèn)|生化儀器廠);FD-1 型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康技術(shù)有限公司);UV 2550 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津儀器有限公司),T10 高速組織勻漿機(jī)（上海越磁電子科技有限公司）。

1.3 紅花蜂花粉多糖

參考文獻(xiàn)[6]稍作改變。稱取紅花蜂花粉500 g，用石油醚回流2 h，過(guò)濾。濾渣自然晾干，用95%乙醇回流2 次，每次2 h,過(guò)濾。濾渣晾干后加15 倍體積蒸餾水，70℃水浴提取8 h 去除水溶性多糖，過(guò)濾。濾渣晾干，加入12 倍體積的0.05 moL/L NaOH 45℃提取4 h，過(guò)濾，收集濾液，濾渣加入8 倍體積的0.05 moL/L NaOH 45℃提取2 h，過(guò)濾，合并濾液，用5.0 moL HAc 中和至pH=7。減壓濃縮，加95%乙醇至終濃度為75%（體積分?jǐn)?shù)），置4℃過(guò)夜，離心取沉淀。沉淀用Sevage 法脫蛋白（三氯甲烷：正丁醇=4∶1）至280 nm 無(wú)明顯吸收峰后，加95%乙醇至終濃度為75%（體積分?jǐn)?shù)），置4℃過(guò)夜，離心取沉淀。沉淀去離子水透析（（MWCO 3500 Da）24 h，醇沉、離心取沉淀，冷凍干燥后溶于適當(dāng)體積蒸餾水，上SephadexG-100 柱（2.5× 30 cm）,蒸餾水洗脫，硫酸-苯酚法跟蹤檢測(cè)，收集490 nm 波長(zhǎng)吸收峰部分，加95%乙醇至終濃度為80%（體積分?jǐn)?shù)），置4℃過(guò)夜，離心取沉淀，沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3 次，冷凍干燥至恒重，得堿提紅花蜂花粉總多糖(alkali-soluble polysaccharide from bee pollen of carthamus tinctorius,APBPC)，置玻璃干燥器中備用。

1.4 動(dòng)物

SPF 級(jí)健康昆明種雄性小白鼠，體重18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠分組、造模、給藥及檢測(cè)樣品制備

取體重18～22 g 的昆明種雄性小鼠50 只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，D-半乳糖衰老模型組及APBPC 低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組每天分別灌胃給與APBPC 100 mg·kg-1，200 mg·kg-1，300 mg·kg-1，空白對(duì)照組及D-半乳糖衰老模型組則灌胃等容積生理鹽水。在給藥的同時(shí),D-半乳糖衰老模型組及APBPC 低、中、高劑量組每天頸背皮下注射D-半乳糖120 mg·kg-1,對(duì)照組同法給生理鹽水，連續(xù)42 天。末次給藥后12 h，斷頭取血，3500 r/m 離心10 min，分離血清置-20℃冰箱保存，在冰浴中迅速剖取肝、腦，并將其置于4℃生理鹽水中，洗凈表面殘留血液，用濾紙吸干，稱濕重，按質(zhì)量與體積比1∶9 加入預(yù)冷的生理鹽水，冰浴勻漿，離心取上清，制備成10% 的組織勻漿，按試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定血清、肝、腦組織SOD 與GSH-Px 活性及MDA含量。

2.2 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以x± s 表示，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0進(jìn)行組間單因素方差分析,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 APBPC 對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠血清中SOD、GSH-Px 活性和MDA 含量的影響

結(jié)果如表1 所示。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，小鼠給予D-半乳糖后，血清SOD 和GSH-Px 的活性顯著降低，MDA 水平明顯升高。而給予APBPC 后，能明顯拮抗D-半乳糖的作用，使小鼠血清SOD 和GSH-Px 的活性回升，MDA 含量減少，但低劑量APBPC 對(duì)GSH-Px 無(wú)明顯影響（P ＞0.05）。

表1 APBPC對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠血清SOD，GSH-Px活性與MDA含量的影響(,n=10)

表1 APBPC對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠血清SOD，GSH-Px活性與MDA含量的影響(,n=10)

注：△△表示與正常空白對(duì)照組相比，P ＜0.01;＊表示與衰老模型組相比，P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01。

3.2 APBPC 對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活性與MDA含量的影響

結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果表明，APBPC 能拮抗D-半乳糖的作用，能升高小鼠肝臟SOD 和GSH-Px 的活性，減少M(fèi)DA 的產(chǎn)生，并呈一定的量效關(guān)系。但APBPC 低劑量組對(duì)MDA 含量無(wú)明顯影響（P＞0.05）。

表2 APBPC對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠-肝組織SOD,GSH-Px活性與MDA含量的影響(,n=10)

表2 APBPC對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠-肝組織SOD,GSH-Px活性與MDA含量的影響(,n=10)

注：△△表示與正?？瞻讓?duì)照組相比，P ＜0.01;＊表示與衰老模型組相比，P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

3.3 APBPC 對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠腦組織中SOD、GSH-Px 活性與MDA 含量的影響

結(jié)果（表3）表明，與衰老模型組相比，APBPC 中、高劑量組均可使腦組織SOD 與GSH-Px 活性明顯升高，MDA 含量顯著降低。同時(shí)，低劑量組APBPC 可使腦組織GSH-Px活性回升，但對(duì)SOD 活性及MDA 含量無(wú)明顯影響（P＞0.05）。

表3 APBPC 對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠腦組織SOD、GSH-Px 活性與MDA 含量的影響(-,n=10)

表3 APBPC 對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠腦組織SOD、GSH-Px 活性與MDA 含量的影響(-,n=10)

注：△△表示與正?？瞻讓?duì)照組相比，P ＜0.01;＊表示與衰老模型組相比，P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01

4 討論

D-半乳糖皮下注射是小鼠衰老造模的常用方法之一。給予小鼠大量的D-半乳糖后，在半乳糖氧化酶的作用下生成乙醛糖并產(chǎn)生超氧陰離子自由基、過(guò)氧化氫等氧化性物質(zhì)，使活性氧增多，脂質(zhì)過(guò)氧化亢進(jìn)，對(duì)機(jī)體造成氧化損害，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體衰老，其生化和組織結(jié)構(gòu)的改變與自然衰老表現(xiàn)基本吻合[9-10]。自由基的產(chǎn)生和機(jī)體對(duì)自由基的清除功能的動(dòng)態(tài)平衡同機(jī)體的衰老有著密切的關(guān)系，MDA 是體內(nèi)自由基反應(yīng)的產(chǎn)物，其含量可間接反映體內(nèi)自由基的多少及反應(yīng)的強(qiáng)度。而SOD、GSH-Px 是體內(nèi)最重要的抗氧化酶類(lèi)之一，在機(jī)體抗氧化、抗自由基損傷中起著重要作用。隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體清除自由基的能力下降，產(chǎn)生自由基和清除自由基的平衡被破壞，自由基堆積，產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物MDA，對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害，進(jìn)而加速機(jī)體衰老[9-11]。因此SOD、GSH-Px 含量的高低可以間接反映機(jī)體清除自由基的能力，MDA 含量的高低可以間接反映細(xì)胞的衰老程度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APBPC 能明顯拮抗D-半乳糖所致小鼠抗氧化能力的降低，使衰老小鼠的SOD、GSH-Px 的活性回升，并減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)對(duì)氧自由基的清除作用，減少體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，改善D-半乳糖引起的氧化應(yīng)激損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示堿提紅花蜂花粉多糖（APBPC）具有較好的抗衰老作用，對(duì)紅花蜂花粉資源的綜合利用及深加工具有重要的參考意義。