4,5-咪唑二羧酸液相色譜分析的研究

王風(fēng)義，王 輝

(1.綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152000；2.山東勝利生物工程有限公司，山東 濟(jì)寧 272173)

4,5-咪唑二羧酸，又稱咪唑-4,5-二羧酸、4,5-咪唑二甲酸、4,5-二羧基咪唑，白色結(jié)晶性粉末。熔點(diǎn)約280℃(分解為咪唑和二氧化碳)，溶于氨或堿溶液，不溶于水、乙醇、乙醚。主要用于合成用于合成頭孢咪唑等原料藥，也可用于配位化合物。由苯并咪唑開環(huán)氧化合成而得。其分析方法一般采用酸堿滴定化學(xué)法，由于4,5-咪唑二羧酸是較弱的二元酸，沒有合適的指示劑且電位突躍不明顯，其檢測結(jié)果的重復(fù)性較差。目前，4,5-咪唑二羧酸液相色譜分析方法沒有報道，所以，我們在多次實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，找到了給定的液相色譜分析的方法，本方法與之前的方法相比之下較為方便簡潔和快速精準(zhǔn)，與雜質(zhì)分離效果較好，在對4,5-咪唑二羧酸工業(yè)品的工業(yè)所需分析中，起到了重要作用，取得了令人滿意的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

甲醇(色譜純)；磷酸(分析純)；超純水；4,5-咪唑二羧酸標(biāo)準(zhǔn)品(98.5%)。

1.2 儀器

P230II型液相色譜儀(或其他型號的帶可變波長紫外檢測器的液相色譜儀)；色譜工作站(或色譜數(shù)據(jù)處理機(jī))；酸度計；超聲波發(fā)生器。

1.3 操作條件

色譜柱：250 mm×4.6 mm (i.d)不銹鋼柱，內(nèi)裝sphersorb C1810 μm(或同種效果的色譜柱)；流動相∶V(甲醇)∶V(水) = 50∶50，用磷酸調(diào)pH值2.0；流速：0.6 mL/ min；檢測波長：254 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。

圖1 樣品液相色譜圖

在給定的色譜條件下，4,5-咪唑二羧酸的保留時間為4.1 min。也可以對儀器中的參數(shù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以此獲得更好地效果，典型色譜圖見圖1。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取0.06 g(準(zhǔn)確至0.0001 g)4,5-咪唑二羧酸標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL的容量瓶中，先加入約30 mL流動相，再逐滴加入0.5 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，加滴加邊搖動，至溶液變澄清，超聲波振蕩后再用流動相定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。

(2)樣品溶液的配制：準(zhǔn)確稱取約含0.06 g(準(zhǔn)確至0.0001 g)4,5-咪唑二羧酸的樣品于50 mL的容量瓶中，先加入約30 mL流動相，再逐滴加入0.5 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，加滴加邊搖動，至溶液變澄清，超聲波振蕩后再用流動相定容，搖勻，0.45 μm濾膜過濾后待用。

(3)分析測定：在上述分析條件下，進(jìn)標(biāo)樣待色譜基線穩(wěn)定之后，直至相鄰兩針標(biāo)樣溶液中4,5-咪唑二羧酸峰面積變化前后差距小于1.5%，按照一針標(biāo)樣，兩針樣品，一針標(biāo)樣的順序進(jìn)行測定。

1.5 計算

取兩針標(biāo)樣溶液和兩針樣品溶液中4,5-咪唑二羧酸面積平均數(shù)。試樣中4,5-咪唑二羧酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X(%)按式(1)計算：

(1)

式中：A1—標(biāo)樣溶液中4,5-咪唑二羧酸峰面積的平均值；

A2—試樣溶液中4,5-咪唑二羧酸峰面積的平均值；

m1—4,5-咪唑二羧酸標(biāo)樣的質(zhì)量，g；

m2—試樣的質(zhì)量，g；

P —標(biāo)樣中4,5-咪唑二羧酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收光譜曲線和檢測波長的選擇

取之前配比好的少量4,5-咪唑二羧酸標(biāo)樣，用流動相稀釋以后，用流動相作為參比，在200～260 nm波長范圍內(nèi)，以每2 nm為一個階段測定一次吸光度，然后以波長為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，建立4,5-咪唑二羧酸標(biāo)樣吸收光譜曲線，如圖2，由曲線可知，4,5-咪唑二羧酸的最大吸收波長分別為216 nm和232 nm。在最大吸收波長下，其靈敏度太高，不利于樣品的稱量，為了便于稱樣，我們選擇254 nm作為檢測波長。

圖2 吸收光譜曲線

2.2 流動相的選擇

分別選擇了不同比例的甲醇和水為流動相，當(dāng)甲醇與水比例為50∶50時，4,5-咪唑二羧酸標(biāo)樣與雜質(zhì)分離較好且保留時間較小，但峰拖尾，調(diào)節(jié)流動相的酸度可改變拖尾情況，以pH值2時拖尾較輕，峰形對稱度較好，所以我們選擇甲醇+水=50+50且以磷酸調(diào)pH值2為流動相進(jìn)行分析，典型的色譜圖見圖1。

2.3 線性范圍的測定

稱取0.01 g到0.09 g的標(biāo)準(zhǔn)品系列，按照實(shí)驗(yàn)方法配制溶液，在給定的色譜分析條件下，每個標(biāo)樣溶液進(jìn)樣3次，以稱取的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，三次進(jìn)樣獲得的4,5-咪唑二羧酸標(biāo)樣峰面積的平均值為縱坐標(biāo)進(jìn)行作圖，得到線性相關(guān)曲線圖，見圖3，并求得回歸直線方程為：A=267984m+1717.6，r2=0.9985，式中：A為峰面積，m為標(biāo)樣質(zhì)量，r為相關(guān)系數(shù)。

圖3 4,5-咪唑二羧酸線性相關(guān)曲線

2.4 精密度的測定

對同一個4,5-咪唑二羧酸樣品，用給定的實(shí)驗(yàn)方法測定6次，分析數(shù)據(jù)見表1，由表1可知，本方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70，變異系數(shù)為0.73%。

表1 精密度的測定

2.5 準(zhǔn)確度的測定

按照添加回收率的測定方法，在已測得含量的樣品中，添加一定量的4,5-咪唑二羧酸標(biāo)準(zhǔn)品，用給定的實(shí)驗(yàn)方法下進(jìn)行分析，經(jīng)計算，方法的平均回收率為100.02%。

由以上結(jié)果和不同實(shí)驗(yàn)室分析比對結(jié)果可知，本文給定的實(shí)驗(yàn)方法適用于4,5-咪唑二羧酸的含量檢測。