用復(fù)合修飾電極示差脈沖伏安法快速測定葉酸含量

王蘇霞，馬永鈞

（甘肅省生物電化學(xué)與環(huán)境分析重點實驗室，化學(xué)化工學(xué)院，西北師范大學(xué)，甘肅 蘭州 730070）

葉酸（Folic Acid，F(xiàn)A） 又稱為碟酰谷氨酸，是一種B族水溶性維生素，在一些新鮮水果、蔬菜、肉類食品中含量豐富。但是，游離葉酸的性質(zhì)極不穩(wěn)定，在光照或加熱的條件下容易發(fā)生分解。人體葉酸攝入不足時會導(dǎo)致一系列疾病，例如巨細(xì)胞性貧血、白細(xì)胞減少、精神障礙等，亦會增加心臟病發(fā)作和中風(fēng)的可能性。孕婦缺乏葉酸還有可能導(dǎo)致胎兒發(fā)育遲緩、神經(jīng)管缺陷，心血管疾病等胎兒畸形問題[1-2]。因此，建立快速、準(zhǔn)確地測定葉酸的分析方法為保障人體健康具有重要的意義[3-4]。

目前，葉酸檢測的方法主要有分光光度法[5]、液相色譜法[6-7]、毛細(xì)管電泳法[8]和熒光法[9]和電化學(xué)方法[10-11]。然而，除電化學(xué)方法外，大多數(shù)測定葉酸的方法在實際應(yīng)用時儀器成本相對較高、分析過程也較為復(fù)雜。例如，雖然液相色譜法具有高靈敏度、高選擇性的優(yōu)點，但在操作過程中，不可避免地要使用大量有機溶劑，且對測試樣需要做一些復(fù)雜的預(yù)處理。葉酸在電極上既可電氧化又可電還原，Gurira等[12]人討論了葉酸的電化學(xué)還原機理及電解質(zhì)pH值對其伏安性質(zhì)的影響。Kretzschmar等[13]人采用極譜法，研究了葉酸、二氫葉酸、四氫葉酸的電還原機理。近年來，由于采用化學(xué)修飾電極測定葉酸的過程相對簡單，且方法穩(wěn)定較好，已被用于食品、藥劑中葉酸含量的測定[14-15]，但測定葉酸的化學(xué)修飾工作電極易毒化失活的問題尚未根本解決。

氨基酸中含有的羧基和氨基官能團(tuán)具有獨特的鰲合和吸附作用，因此應(yīng)用電化學(xué)聚合方法可以將氨基酸聚合到不同電極表面上，制備可用于檢測目標(biāo)化合物的電化學(xué)傳感器[16-17]。近年來，含稀土元素雜金屬氰橋配位聚合物的化學(xué)修飾材料被廣泛的用于電化學(xué)傳感器，這種聚合物膜修飾電極具有高選擇性、高靈敏度和優(yōu)異的電催化活性與抗電極毒化失活的能力，對一些生物小分子具有高效的電催化氧化作用[18-19]。因此，本文將聚谷氨酰胺修飾層與CyHMCP材料進(jìn)行復(fù)合修飾，成功制備出一種新型的復(fù)合修飾玻碳電極(Poly(L-glutamine)/Ho(III)-Fe(III)-WO42-CyHMCP/GCE)，利用該電極對葉酸的電催化氧化活性，建立了一種直接、快速測定實際試樣中葉酸含量的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電化學(xué)工作站（CHI 760B，上海辰華儀器公司）；酸度計（PB-10，德國賽多利斯儀器有限公司）；磁力攪拌器（85-2，中國國華儀器公司）。電化學(xué)實驗均采用三電極測試體系，以直徑為3 mm的修飾或者未修飾的玻碳電極為工作電極，鉑絲為對電極，Ag/AgCl（0.1 mol·L-1KCl）為參比電極。

谷氨酰胺（含量≥99%，阿拉丁試劑）；氧化鈥（含量≥99.99%，阿拉丁試劑）；鐵氰化鉀（A.R，經(jīng)重結(jié)晶純化）；三聚氰胺（含量≥99.5%，阿拉丁試劑）；葉酸（FA，含量≥97%,阿拉丁試劑）。其余試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水，所有測試均在室溫條件下進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液置于4℃的冰箱冷藏室中保存。

10mmol/L葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：稱量0.1138g葉酸固體，溶于Na2CO3（C=0.10mol/L）中。1mmol/L和0.1 mmol/L的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液均由10 mmol/L葉酸溶液用Na2CO3（C=0.05mol/L） 稀釋所得。

1.2 Poly(L-glutamine)/Ho(III)-Fe(III)-WO42-CyHMCP/GCE的制備過程

裸玻碳電極 （GCE） 依次用 0.3μm及 0.05 μm的Al2O3懸濁液拋光至鏡面，用麂皮擦拭電極表面殘留Al2O3，再將此電極依次用無水乙醇、去離子水中分別超聲清洗2min，最后用蒸餾水沖洗干凈，備用。

參考文獻(xiàn)方法[20]，先將電極進(jìn)行預(yù)處理。把 GCE放入 10mL磷酸鹽緩沖溶液 （PBS，0.10mol/L，pH=7.0） 中，在1.7V的電位下陽極氧化處理400 s，接著在0～1V范圍內(nèi)循環(huán)掃描20圈后取下電極，將電極表面氧化產(chǎn)生的過量黑色物質(zhì)用濾紙輕輕擦去，用水沖洗。再參照文獻(xiàn)方法[19,21]，將活化后的GCE置于含2.50μmol/L谷氨酰胺，0.10mol/L PBS緩沖溶液 (pH=9.3)，0.10mol/L Na2SO4的電解質(zhì)溶液中，在-0.9～2.23V電位區(qū)間內(nèi)循環(huán)掃描5圈后取出，用蒸餾水沖洗電極表面。再修飾含鈥雜金屬氰橋配位聚合物膜(Ho(III)-Fe(III)-WO42-CyHMCP)，置于電沉積CyHMCP電鍍液中，用循環(huán)伏安模式，在電位區(qū)間0.6～-0.32 V，掃速17mV·s-1的條件下，循環(huán)掃描4圈。此電鍍液組成為Ho3+(10.0mmol/L，2.25 mL)，三聚氰胺 (10.0mmol/L，1.50mL)，一氯乙酸-氫氧化鈉緩沖溶液 (0.20mol/L，5.0mL，pH1.63)，KNO3(0.5mol/L，0.86mL)，F(xiàn)e(CN)63+(10.0mmol/L， 0.45mL) ， Fe3+(10.0mmol/L，23.3μL)， WO42-(10.0mmol/L， 0.28 mL)， 曲 通（1.0%，1.4 mL），電鍍完成后將修飾好的電極用二次蒸餾水沖洗干凈、備用。

1.3 實際樣品處理

所需樣品均購買于當(dāng)?shù)爻小２げ?、芹菜、蘋果等樣品按以下程序進(jìn)行預(yù)處理：將樣品切碎，各稱取25.00g，放入研缽中研磨處理后，置于 50mL水溶液 （組成：50mmol/L NaOH，50mmol/L Na2SO4，2.5mmol/L硼砂溶液） 中超聲提取 30min，再進(jìn)行離心分離 (12000r/min，10min)；不同品牌的葉酸片樣品準(zhǔn)確稱量后放入研缽中研碎，轉(zhuǎn)移至50mL比色管中，在加入50mmol/L NaOH，50mmol/L Na2SO4，2.5mmol/L 硼砂溶液，定容至刻度，超聲提取30min，再離心分離 (12000r/min，10min)，取一定量的上清液進(jìn)行電化學(xué)測定。

1.4 實驗步驟

在10mL比色管中，準(zhǔn)確加入0.10mol·L-1PBS 緩沖溶液 (pH=8.0)，0.3mol·L-1的 Na2SO4溶液及一定量的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，用超純水定容，充分搖勻后轉(zhuǎn)移至石英電解池中，采用三電極體系，用示差脈沖伏安法（DPV），在磁力攪拌的條件下富集50s，停止攪拌后靜止5s，進(jìn)行電化學(xué)實驗。儀器參數(shù)設(shè)置為：脈沖寬度（60ms），脈沖高度（100mV），脈沖間隔時間（200ms），在0.20～0.90V電位區(qū)間記錄示差脈沖伏安圖并讀取葉酸的氧化峰電流值。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行實際樣品中葉酸含量的定量，以外推負(fù)截距值計算待測液中葉酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合修飾電極的穩(wěn)定性及對葉酸的電催化性能

根據(jù)文獻(xiàn)可知，葉酸在裸玻碳電極上幾乎觀察明顯的氧化峰[22-23]，而采用本實驗修飾的新型電極后，用含40.0μmol·L-1葉酸標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液連續(xù)掃描10次的示差脈沖伏安曲線時，觀察到葉酸具有明顯的伏安響應(yīng)峰（如圖1所示）。此外，在多次連續(xù)掃描過程中所得到葉酸的氧化峰峰形，峰電流值、峰電位值重現(xiàn)性均很好，這說明此復(fù)合修飾電極對葉酸的電催化活性及穩(wěn)定性良好。

圖1 葉酸在修飾電極上連續(xù)掃描的示差脈沖伏安圖。

2.2 支持電解質(zhì)的影響

在測定葉酸時，本文比較了磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、稀硫酸溶液、Tris-HCl緩沖溶液等作為支持電解質(zhì)時葉酸的伏安行為。實驗發(fā)現(xiàn)若其他條件相同時，在稀硫酸電解質(zhì)溶液中，葉酸會同時出現(xiàn)兩個氧化峰，不便于定量分析。而在Tris-HCl緩沖液電解質(zhì)中，葉酸的檢測靈敏度、電流響應(yīng)能力較低。再參照文獻(xiàn)[23]，也觀察到葉酸在堿性條件下化學(xué)穩(wěn)定性優(yōu)于酸性條件。因此，以含25.0μmol·L-1葉酸標(biāo)準(zhǔn)樣品為測試液，用DPV法考察了PBS緩沖液的濃度和pH值對葉酸電化學(xué)響應(yīng)的影響。由圖2可知，當(dāng)濃度為0.10mol·L-1，pH=8.0時，葉酸的響應(yīng)電流值達(dá)到最大。所以本方法以PBS為測定葉酸的最佳支持電解質(zhì)。

圖2 支持電解質(zhì)濃度 (A)和pH值 (B)對葉酸峰電流的影響。

2.3 葉酸的氧化峰電流與掃速的關(guān)系

用線性掃描伏安法 (LSV)研究了葉酸的峰電流與掃描速度 (Ip～v)的關(guān)系，如圖3所示，實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)掃描速率在0.05～0.60V/s范圍變化時，隨著掃速的增加，葉酸的氧化峰電位正移，響應(yīng)電流逐漸增加，符合不可逆電化學(xué)氧化反應(yīng)的特征。葉酸的氧化峰電流與掃速呈良好的正比線性關(guān)系 (圖3插圖)，擬合方程為：Ip(μA)=5.074+16.42 v(V/s)，R2=0.9981，這說明在此修飾電極上，葉酸的電催化氧化反應(yīng)屬于典型的吸附控制過程。

圖3 修飾電極上葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同掃速下的線性掃描伏安曲線（插圖為葉酸氧化峰電流與掃描速率的關(guān)系）。

2.4 定量分析葉酸的工作曲線

在最佳實驗條件下，以復(fù)合修飾電極工作電極，所記錄葉酸的伏安響應(yīng)曲線如圖4所示。隨著待測樣品中葉酸濃度的增加，其氧化峰電流也相應(yīng)增大。實驗數(shù)據(jù)顯示，在5.00～600μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，葉酸的氧化峰電流與其濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系 (見圖4內(nèi)插圖)，線性回歸方程為 Ip(μA)=-0.04017+0.01159CFA(μmol·L-1)，R2=0.9994；檢出限 (S/N=3) 為 2.0μmol·L-1。此外，在實驗過程中還觀察到葉酸在此復(fù)合修飾電極上亦可進(jìn)行電催化還原，這種現(xiàn)象與聚次甲基藍(lán)修飾玻碳電極上葉酸的電還原性質(zhì)相似[24]。但文獻(xiàn)中采用循環(huán)伏安法的陰極峰電流為定量參數(shù)，其定量分析葉酸的線性響應(yīng)范圍只有0.1×10-3～2.9×10-3mol/L狹窄的一個數(shù)量級左右。這主要是伴隨電還原過程，葉酸在工作電極上會產(chǎn)生強的不可逆吸附，甚至電極上還有可能發(fā)生局部的電聚合作用導(dǎo)致了工作電極被污染、毒化失活，使定量分析工作難以為繼。而本實驗采用葉酸的電氧化峰電流為分析參數(shù)就可以避免電極污染問題，使本分析方法應(yīng)用于實樣測定的準(zhǔn)確度得到極大的提高。

圖4 不同濃度葉酸的示差脈沖伏安圖（插圖為葉酸的氧化峰電流和濃度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線）

2.5 共存干擾物的影響

以質(zhì)量濃度為18.0 mg·L-1的葉酸標(biāo)準(zhǔn)樣品為檢測樣，我們考察了加入一些干擾物為測定基底物質(zhì)對葉酸峰電流的影響。結(jié)果證明：若以峰電流值變化幅度小于±5%內(nèi)為界限，添加80倍的KNO3、NaNO3、NaCl，40 倍的葡萄糖，30 倍的蔗糖，60倍的果糖，20倍的草酸鈉，5倍的L-抗壞血酸，40倍的尿素、淀粉、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，5倍的賴氨酸對葉酸的測定均無明顯影響。這說明限量存在的這些基底干擾物質(zhì)對檢測葉酸的影響均不大，也證明此復(fù)合修飾電極具有良好的選擇性和抗干擾性能。

2.6 實際樣品分析

準(zhǔn)確移取一定體積的2.3中所得的待測液，按2.4的步驟，用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行葉酸含量的測定。不同樣品中葉酸含量的測定結(jié)果如表1所示，其回收率在95.9%～109%。從表1中數(shù)據(jù)可以得出，三種不同品牌的葉酸片，經(jīng)過預(yù)處理，測得葉酸的含量為其理論值的96.7%～108%，這說明用本方法對葉酸片中葉酸的定量準(zhǔn)確、可靠，結(jié)果令人滿意。在幾種蔬菜及水果中并未檢測到葉酸，但在進(jìn)行加標(biāo)測定實驗中，計算得到實樣的加標(biāo)回收率能達(dá)到95.9%～99.4%，表明此復(fù)合修飾電極上的適用性良好，葉酸的檢測也并未受實際樣品中已有復(fù)雜基底成分的干擾，本方法的選擇性良好。

表1 藥片和食品中葉酸含量的測定結(jié)果及回收率 (n=3)。Table 1 Determination results of folic acid content in the real samples (n=3).

3 結(jié)語

本實驗在Poly(L-glutamine)/Ho(III)-Fe(III)-WO42-CyHMCP/GCE復(fù)合修飾玻碳電極上研究了葉酸的電催化氧化行為，初步解決了用化學(xué)修飾工作電極測定葉酸時易毒化失活的問題，據(jù)此建立了一種快速、直接測定葉酸片中葉酸含量的新方法，本方法的樣品前處理簡單、電極穩(wěn)定性好、抗毒化性能強、線性范圍寬，對幾種實際樣品中葉酸含量進(jìn)行了測定，回收率達(dá)到95.9%～109%，測定結(jié)果令人滿意。