油用牡丹鳳丹種子休眠解除及組織培養(yǎng)研究

韋祖粉， 蒲振蕊， 魯清清， 王 娟， 藍(lán)增全， 吳 田

(1.國家林業(yè)草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心/西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院， 云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 云南 昆明 650224；3.西南林業(yè)大學(xué)綠色發(fā)展研究院, 云南 昆明 650224)

油用牡丹(Paeoniaostii)屬于芍藥科芍藥屬牡丹組多年生落葉小灌木，生長于我國山東、河南、四川、陜西、云南等省?；▽儆谥袊鴤鹘y(tǒng)名花之一，可以用于制作食品和飲料；根被稱為“丹皮”，具有降低血壓、抗菌消炎的功效。油用牡丹除了觀賞、藥用價值外還具有很高的油用價值，其籽油中不飽和脂肪酸含量達(dá)總量的90%以上，不飽和脂肪酸中α-亞麻酸含量達(dá)40%以上，被稱為“世界上最好的油”[1]，已被國家農(nóng)業(yè)部確認(rèn)為一種新的食品[2-3]，作為一種新的木本油料作物資源[4-5]。

由于牡丹種子休眠的特性，種子萌發(fā)要求條件較高、繁殖周期較長、自然繁殖出苗率低等原因，且播種的時間也會影響其種子的出芽率[6]。傳統(tǒng)的繁殖方式遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足牡丹的大量生產(chǎn)，牡丹離體再生技術(shù)是目前最常用的技術(shù)，Demoise等[7]于1969年用牡丹種子的成熟胚為外植體成功誘導(dǎo)出愈傷組織。牡丹胚培養(yǎng)技術(shù)能夠有效打破其種胚休眠，縮短萌發(fā)時間[8]。在牡丹種胚離體繁殖時必須打破休眠，獲得生根苗，因?yàn)樽匀粭l件下其種子生根發(fā)芽困難，不能批量、高效的生產(chǎn)。所以，實(shí)現(xiàn)牡丹產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，需解決種子休眠、生根難的問題。

本研究通過解除鳳丹種子休眠，利用無菌胚苗為外植體進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)及生根研究，提高鳳丹的生根率及再生能力，建立鳳丹種胚離體再生體系，為鳳丹的快速繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1植物材料

牡丹鳳丹種子收集于種植在山東省菏澤市牡丹種植基地的4年生牡丹植株。

1.1.2培養(yǎng)條件

WPM培養(yǎng)基pH為6.2，其余培養(yǎng)基pH均為5.8。除無糖培養(yǎng)基外，其余培養(yǎng)基中附加蔗糖30 g·L-1，瓊脂7.6 g·L-1。在培養(yǎng)室(24±2)℃進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行計算和單因素方差分析及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯著水平p<0.05。

1.2 研究方法

1.2.1微波及赤霉素對鳳丹種子解除休眠處理

鳳丹種子解除休眠使用微波輻射和赤霉素(GA3)浸泡處理，解除鳳丹種子休眠微波輻射時間和火力組合(表1)，共9個組合；赤霉素(GA3)浸泡時間和濃度組合(表2)，共13個組合。

表1 微波時間和火力處理組合

表2 赤霉素(GA3)浸泡時間和濃度組合

試驗(yàn)號赤霉素濃度/(mg·L-1)浸泡時間/h1002500123100012415001252000126500247100024815002492000241050048111000481215004813200048

1.2.2不同激素配比對處理種子萌發(fā)影響

經(jīng)解除休眠處理的種子在無菌操作環(huán)境下進(jìn)行消毒處理，先用75%乙醇浸泡消毒30 s，無菌水清洗2次，使用2%的次氯酸鈉浸泡消毒4 min，無菌水清洗2次，再次重復(fù)使用2%的次氯酸鈉浸泡消毒4 min，無菌水清洗5次，切取種胚接種到不同類型培養(yǎng)基及不同激素組合培養(yǎng)基中，觀察其萌發(fā)情況，并分別統(tǒng)計萌發(fā)率[萌發(fā)率(%)=(種胚萌發(fā)數(shù)/不同處理的種胚數(shù))×100%]。鳳丹種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、1/2 MS培養(yǎng)基、MS無糖培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、1/2 WPM培養(yǎng)基、WPM無糖培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)基各接種40瓶，每瓶接種1棵種胚，不同培養(yǎng)基各重復(fù)3次試驗(yàn)；不同激素組合WPM培養(yǎng)基(表3)，共10種不同激素WPM培養(yǎng)基組合，以6-BA、GA3兩種激素并添加不同濃度Ca(NO3)2進(jìn)行鳳丹種子萌發(fā)，不同激素組合培養(yǎng)基各接種40瓶，每瓶接種1棵種胚，每升WPM培養(yǎng)基中添加1 mg·L-1PVP，不同激素組合培養(yǎng)基各重復(fù)3次試驗(yàn)。

表3 不同激素組合WPM培養(yǎng)基

激素培養(yǎng)基編號不同激素質(zhì)量濃度/(mg·L-1)6-BAGA3Ca(NO3)2/(mg·L-1)10.53121.05131.53242.05251.03361.05372.05181.53292.053103.051

1.2.3鳳丹生根及快速繁殖

1) WPM培養(yǎng)基中不同激素組合誘導(dǎo)鳳丹叢生芽。

以鳳丹無菌苗為外植體，在WPM培養(yǎng)基中添加IBA、6-BA兩種植物激素誘導(dǎo)叢生芽，培養(yǎng)基中附加2 mg·L-1PVP和250 mg·L-1Ac，不同激素濃度組合各接種20瓶，每瓶接種2棵無菌苗。每7 d觀察1次生長情況，接種40 d后統(tǒng)計叢生芽的增殖系數(shù)，叢生芽增殖系數(shù)=(收獲后叢生芽個數(shù)—接種叢生芽個數(shù))/接種叢生芽個數(shù)。不同激素組合WPM培養(yǎng)基誘導(dǎo)鳳丹叢生芽(表4)，共11種不同激素組合WPM培養(yǎng)基。

表4 不同激素組合WPM培養(yǎng)基誘導(dǎo)鳳丹叢生芽

培養(yǎng)基編號植物激素濃度/(mg·L-1)IBA6-BA10.00.021.00.531.51.040.51.551.02.062.00.571.01.582.01.091.52.0100.52.5112.03.0

2) 不同基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)鳳丹叢生芽生根。

以鳳丹叢生芽為外植體，接種至MS培養(yǎng)基、1/2 MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、1/2 WPM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，不同培養(yǎng)基各接種20瓶，每瓶接種1棵叢生芽。每10 d觀察1次生長情況，接種35 d后統(tǒng)計生根數(shù)及生根率[生根率(%)=(生根的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%]。

3) WPM培養(yǎng)基中不同激素組合誘導(dǎo)鳳丹叢生芽生根。

以鳳丹叢生芽為外植體，接種至含有不同濃度IBA、NAA組合的WPM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。不同激素濃度組合各接種30瓶，每瓶接種1棵叢生芽。每10 d觀察1次生長情況，接種35 d后統(tǒng)計生根數(shù)及生根率。WPM培養(yǎng)基中不同IBA、NAA濃度組合誘導(dǎo)鳳丹叢生芽生根(表5)，共17種組合。

表5 WPM培養(yǎng)基中不同IBA、NAA濃度組合誘導(dǎo)鳳丹叢生芽生根

培養(yǎng)基編號植物激素濃度/(mg·L-1)IBANAA100.0210.5320.5430.5540.5611.0721.0831.0941.01011.51121.51231.51341.51412.01522.01632.01742.0

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輻射對鳳丹種子解除休眠及萌發(fā)的影響

微波火力為10處理時間15 s、30 s與微波火力為20處理時間15 s萌發(fā)率最高，為33.85%；微波火力為30處理時間30 s和60 s的組合萌發(fā)率為0(表6)。因此，隨著微波火力與處理時間不斷增加，鳳丹種子萌發(fā)率降低甚至不萌發(fā)，可能是微波火力太強(qiáng)且處理時間過長導(dǎo)致種子失去自由水水分，胚破壞，失去活力。

表6 微波處理解除休眠對鳳丹種子萌發(fā)的影響

處理組萌發(fā)數(shù)/個萌發(fā)率/%10±0.58a0.83±1.44a212±1.53d30.83±3.82d313±1.53d33.35±3.85d47±1.53c18.33±3.82c512±1.53d30.83±3.82d66±0.58bc15.83±1.44bc74±0.58b10.83±1.44b84±1.53b10.83±3.82b90±0.00a0±0.00a100±0.00a0±0.00a

注：同列不同小寫字母之間表示差異顯著(p<0.05)，相同字母之間表示差異不顯著(p>0.05)。下同。

2.2 赤霉素(GA3)浸泡處理對鳳丹種子解除休眠及萌發(fā)的影響

1 000 mg·L-1赤霉素(GA3)浸泡24 h、1 500 mg·L-1GA3浸泡24 h、2 000 mg·L-1GA3浸泡24 h、1 000 mg·L-1GA3浸泡48 h、1 500 mg·L-1GA3浸泡48 h、2 000 mg·L-1GA3浸泡48 h的處理方式萌發(fā)率較好；GA3500 mg·L-1浸泡12 h萌發(fā)率最低，與其他處理組有顯著差異(表7)。因此，綜合處理濃度和時間的影響因素，解除鳳丹種子休眠的最佳處理方式為1 000 mg·L-1GA3浸泡24 h。

表7 赤霉素(GA3)浸泡處理打破休眠對鳳丹種子萌發(fā)的影響

處理組萌發(fā)數(shù)/個萌發(fā)率/%10±0.58a0.83±1.44a29±1.53b23.33±3.82b312±1.15c30.83±2.89c416±1.00d40.00±2.50d516±1.53d39.16±3.82d612±1.53bc29.16±3.82bc721±1.53e52.50±3.82e820±1.15e50.83±2.89e921±2.08e51.67±5.20e1016±1.73d40.00±4.33d1121±1.53e51.67±3.82e1221±1.53e53.33±3.82e1321±0.58e53.33±1.44e

2.3 不同類型培養(yǎng)基對鳳丹無菌苗獲得的影響

WPM培養(yǎng)基中鳳丹無菌苗萌發(fā)率最高，為60.83%，MS無糖培養(yǎng)基萌發(fā)率最低，為19.17%(表8)。因此，使用WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基更有利于促進(jìn)鳳丹種子萌發(fā)。

表8 不同基本培養(yǎng)基類型對鳳丹種子萌發(fā)的影響

編號培養(yǎng)基類型萌發(fā)數(shù)/個萌發(fā)率/%1MS培養(yǎng)基 13±0.58c33.33±1.44c21/2MS培養(yǎng)基 11±1.53b26.67±3.82b3MS無糖培養(yǎng)基 8±1.53a19.17±3.82a4WPM培養(yǎng)基 24±2.08d60.83±5.20d51/2WPM培養(yǎng)基 16±1.15c39.17±2.89c6WPM無糖培養(yǎng)基10±1.53b25.83±3.82b

2.4 WPM激素培養(yǎng)基獲取鳳丹無菌苗的影響

9號培養(yǎng)基組合萌發(fā)率最高，為93.3%，1號培養(yǎng)基上萌發(fā)率最低，為43.33%(表9)。在6-BA、Ca(NO3)2濃度都相同的情況下，一定濃度的GA3有利于種子的萌發(fā)；低濃度的6-BA和過高濃度的6-BA都不利于種子萌發(fā)。因此，鳳丹種子萌發(fā)最適激素培養(yǎng)基為WPM+1 mg·L-1PVP+5 mg·L-1GA3+ 1.5 mg·L-16-BA + 5 mg·L-1Ca(NO3)2。

表9 不同激素組合WPM培養(yǎng)基對鳳丹種子萌發(fā)的影響

編號萌發(fā)數(shù)/個萌發(fā)率/%117±1.53a43.33±3.82a221±1.53bc53.33±3.82bc319±1.15ab46.67±2.89ab422±1.53c55.83±3.82c520±1.53abc50.83±3.82abc629±1.53e73.33±3.82e726±1.00d65.00±2.50d831±2.00e77.50±5.00e937±2.08f93.30±5.20f1032±2.52e79.17±6.29e

2.5 WPM培養(yǎng)基中不同激素濃度組合對鳳丹叢生芽增殖的影響

9號培養(yǎng)基組合叢生芽增殖系數(shù)最高，為2.20；在對照組1號培養(yǎng)基中叢生芽增殖系數(shù)最低，為1，且芽纖弱；在7號和9號培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的叢生芽長勢壯，在1、2、6、10、11號培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出的叢生芽長勢纖弱；在4、5、7、9、10號培養(yǎng)基上叢生芽增殖系數(shù)在1.5以上(表10)。因此，IBA、6-BA濃度過高會抑制鳳丹叢生芽的誘導(dǎo)，鳳丹叢生芽誘導(dǎo)增殖的最佳培養(yǎng)基為WPM+1.5 mg·L-1IBA+2 mg·L-16-BA+2 mg·L-1PVP+250 mg·L-1AC。

表10 不同激素組合WPM培養(yǎng)基對鳳丹叢生芽增殖的影響

編號增殖芽數(shù)/個增殖系數(shù)芽生長情況140±0.00a1.00±0.00a纖弱245±2.00ab1.12±0.05ab纖弱349±2.00bc1.23±0.05bc一般463±3.00e1.57±0.07e一般576±5.00f1.91±0.11f一般656±3.00d1.42±0.08d纖弱764±3.00e1.61±0.06e壯852±4.00cd1.29±0.09cd一般988±4.00g2.20±0.09g壯1066±4.00e1.65±0.09e纖弱1148±4.00bc1.21±0.09bc纖弱

2.6 不同類型培養(yǎng)基對鳳丹叢生芽生根的影響

WPM培養(yǎng)基叢生芽生根率最高，為21.67%；1/2 MS培養(yǎng)基、1/2 WPM培養(yǎng)基生根率無顯著差異，MS培養(yǎng)基和WPM培養(yǎng)基生根率無顯著差異，但使用WPM培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)叢生芽生根時生根率高于MS培養(yǎng)基(表11)。因此，鳳丹叢生芽誘導(dǎo)生根最適基本培養(yǎng)基為WPM培養(yǎng)基。

表11 不同基本培養(yǎng)基對鳳丹叢生芽生根的影響

編號培養(yǎng)基類型生根數(shù)/個生根率/%1MS培養(yǎng)基 1±0.58a6.67±2.89b21/2MS培養(yǎng)基 0±0.58a1.67±2.89a3WPM培養(yǎng)基 4±1.15b21.67±5.77b41/2WPM培養(yǎng)基2±0.58a8.33±2.89a

2.7 WPM培養(yǎng)基中不同激素濃度組合對鳳丹叢生芽生根的影響

11號培養(yǎng)基生根率最高，為55.56%，1、2、17號培養(yǎng)基生根率最低，7、11、13、14號培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的根粗壯，但13、14號培養(yǎng)基中的植株長勢較弱，7、10、11、12、15、16號培養(yǎng)基中的植株長勢較壯，但10、16號培養(yǎng)基中植株的根長勢較細(xì)(表12)。IBA濃度固定在同一濃度時，NAA濃度對于根的誘導(dǎo)無顯著影響，但會影響植株的生長狀態(tài)；NAA濃度固定在同一濃度時，IBA濃度對生根有影響，高濃度的IBA會抑制根的生成。因此鳳丹叢生芽誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為WPM+2 mg·L-1IBA+1.5 mg·L-1NAA。

表12 不同激素濃度WPM培養(yǎng)基對鳳丹叢生芽生根的影響

編號生根數(shù)/個生根率/%根狀態(tài)植株生長狀態(tài)10±0.00a0.00±0.00a-弱20±0.58a1.11±1.92a-弱33±2.08abc8.89±6.94abc細(xì)較弱44±2.65cd13.33±8.82cd較細(xì)較弱52±1.53abc7.78±5.09abc細(xì)弱66±2.52de21.11±8.39de較粗較弱79±2.00e30.00±6.67e粗較壯84±2.08bcd12.22±6.94bcd較粗較弱91±1.15ab2.22±3.85ab較細(xì)弱108±1.15e25.56±3.85e細(xì)較壯1117±2.52g55.56±8.39g粗較壯1213±1.73f43.33±5.78f較粗較壯131±1.53abc4.44±5.09abc粗較弱148±1.15e27.78±3.85e粗較弱157±1.53de22.22±5.09de較粗壯162±1.53abc5.56±5.09abc較細(xì)較壯170±0.58a1.11±1.92a-弱

3 討 論

鳳丹牡丹種子有休眠的特征，在自然狀態(tài)下，種子發(fā)芽較為困難，周期較長，達(dá)半年之久，且出苗率較低[9-11]。鮑雪纖等在微波輻射處理滇青岡種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，微波輻射能夠激活種子胚胎細(xì)胞的生長機(jī)制，提高了滇青岡種子的發(fā)芽率[12]；吳旭紅等研究表明，有效的熱擊處理能提高大豆種子的發(fā)芽率[13]。GA3促進(jìn)種子萌發(fā)，提高種子的發(fā)芽率，在多種作物上得到廣泛應(yīng)用[14-16]。在微波輻射解除鳳丹種子休眠的實(shí)驗(yàn)中，未獲得較高的萌發(fā)率，關(guān)于微波處理解除鳳丹種子休眠還需進(jìn)一步研究，優(yōu)化改進(jìn)時間和火力組合。GA3浸泡處理解除鳳丹種子休眠的實(shí)驗(yàn)中，隨著GA3濃度和浸泡時間的增加，鳳丹種子萌發(fā)率不斷上升。

在植物組織培養(yǎng)中植物激素是影響植株再生的主要因素，植物生長發(fā)育過程中，本身也會產(chǎn)生一定的內(nèi)源激素，而內(nèi)源激素對植物器官的發(fā)生有重要的作用，同時外源激素的調(diào)節(jié)也很重要[17]。外源生長素和細(xì)胞分裂素在植物器官的誘導(dǎo)和分化在植物生長發(fā)育中起到關(guān)鍵性作用[18]。本研究中，IBA、6-BA濃度過高會影響鳳丹叢生芽的誘導(dǎo)，在鳳丹叢生芽誘導(dǎo)增殖的培養(yǎng)基中附加 IBA 1.5 mg·L-1和 6-BA 2 mg·L-1誘導(dǎo)的叢生芽效果最佳。WPM培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根率高于MS培養(yǎng)基，可能是因?yàn)閃PM培養(yǎng)基適用于木本植物的原因[19]。在WPM培養(yǎng)基中附加2 mg·L-1IBA和1.5 mg·L-1NAA誘導(dǎo)鳳丹叢生芽生根率為55.56%，根粗壯生長良好，隨著IBA和NAA濃度的增加，誘導(dǎo)根的效果不佳且產(chǎn)生的不定根明顯減少。研究表明，適當(dāng)?shù)蜏靥幚砜商岣唠x體培養(yǎng)外植體的生根率[20]。本實(shí)驗(yàn)對鳳丹種子解除休眠、叢生芽誘導(dǎo)生根的研究沒有達(dá)到較好的效果，可能是微波處理時間和火力組和不合理，以及不同激素濃度組合單一等原因，所以，找到更適合鳳丹牡丹生根的方法，穩(wěn)定又能得到大量生根苗對牡丹產(chǎn)業(yè)具有重要意義。