醫(yī)院感染銅綠假單胞菌β-內(nèi)酰胺酶基因型分析

王 楊,高 輝,黃云昆,付曉野,徐 敏

(昆明市延安醫(yī)院檢驗(yàn)科,云南昆明 650051）

銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa,PA）廣泛分布于自然界,屬于條件致病菌,在正常人體內(nèi)很少致病,卻是醫(yī)院感染的重要病原菌之一。隨著新型廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用,PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥性日益嚴(yán)重,限制了抗生素的選擇,給臨床抗感染治療帶來(lái)了極大的困擾。該研究收集臨床標(biāo)本中分離的20株P(guān)A,通過(guò)研究其β-內(nèi)酰胺酶基因型及耐藥性特點(diǎn),為進(jìn)一步研究昆明地區(qū)PA耐藥基因的分布情況奠定基礎(chǔ),為減少耐藥PA的產(chǎn)生、提高臨床抗感染治療效果提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2009年6月-2009年10月昆明市延安醫(yī)院(三甲醫(yī)院）臨床標(biāo)本中分離的非重復(fù)性PA20株。質(zhì)控菌為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2 藥敏紙片和培養(yǎng)基

16種藥敏紙片種類詳見(jiàn)藥敏結(jié)果表中所列,亞胺培南、美洛培南、環(huán)丙沙星、為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品,其余藥敏紙片為北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)品。藥敏試驗(yàn)用M-H培養(yǎng)基,為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)菌鑒定與藥敏試驗(yàn)

用法國(guó)生物梅里埃VITEK32細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定,藥敏試驗(yàn)采用K-B瓊脂擴(kuò)散法,按美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS）的標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏試驗(yàn)結(jié)果。

1.4 提取細(xì)菌基因組DNA

用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌DNA,按試劑盒說(shuō)明書操作,試劑盒由天根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.5 檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因

用Biometra Personal Cycler PCR儀擴(kuò)增7種β-內(nèi)酰胺酶基因,PCR擴(kuò)增引物由北京百泰克生物技術(shù)有限公司合成,7種靶基因引物序列見(jiàn)表1[1]。PCR擴(kuò)增體系均為 :2 ×Taq Master Mix 25 μ L,模板 0.5 μ L,P1 引物2 μ L,P2 引物 2 μ L,無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至50 μ L(Taq PCR MasterMix購(gòu)自北京博邁德科技發(fā)展有限公司）。熱循環(huán)參數(shù)均為:94℃2 min,然后94℃60 s→55℃60 s→72℃60 s,循環(huán)35個(gè)周期,最后72℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,EB染色,Bio-Rad Laboratories 6000凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果,并攝像保存。

表1 PCR引物序列

1.6 基因序列測(cè)定與分析

β-內(nèi)酰胺酶基因擴(kuò)增的陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)純化后,用ABI 377全自動(dòng)DNA序列分析儀進(jìn)行序列測(cè)定,所測(cè)序列用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

20株P(guān)A對(duì)16種抗菌藥物的敏感性,見(jiàn)表2。

2.2 β-內(nèi)酰胺酶基因PCR檢測(cè)結(jié)果

20株P(guān)A均檢測(cè)出TEM 基因,而SHV、OXA、PER、VEB、GES、CTX-M-1基因擴(kuò)增均為陰性。

2.3 序列分析及比對(duì)

本研究對(duì)6個(gè)菌株的TEM基因PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序,共測(cè)得523個(gè)核苷酸。該序列與β-內(nèi)酰胺酶TEM-1的編碼基因(GenBank注冊(cè)號(hào):NC013365.1）同源性為99%。

3 討論

PA是醫(yī)院感染的重要病原菌之一,其對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥性呈逐年上升趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn),PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制是細(xì)菌產(chǎn)生各種 β-內(nèi)酰 胺酶(β-lactamases,BLA）,β-內(nèi)酰胺酶基因可由質(zhì)粒介導(dǎo),通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合、傳遞等方式在同種或不同種屬菌株間轉(zhuǎn)移和傳播,造成院內(nèi)感染流行[2]。在各個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行的BLA基因型各有不同[3-5]。

該研究中的20株P(guān)A均檢測(cè)出TEM-1型β-內(nèi)酰胺酶基因,與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)的檢測(cè)結(jié)果有一定差別[6,7]。導(dǎo)致菌株β-內(nèi)酰胺酶基因攜帶率不同的原因可能與菌株來(lái)源(地理位置）和各地區(qū)醫(yī)院抗菌藥物的使用習(xí)慣不同有關(guān)。TEM-1是革蘭陰性菌中最常見(jiàn)的一種廣譜β-內(nèi)酰胺酶(SBL）,能水解青霉素和低代頭孢菌素如頭孢噻吩和頭孢噻啶等。在新一代抗生素選擇性壓力等因素的影響下,細(xì)菌的β-內(nèi)酰胺酶基因突變,可由廣譜酶TEM-1、2發(fā)生1-5個(gè)氨基酸改變而衍生出超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs）,能水解廣譜青霉素、第三代頭孢類及單環(huán)類抗生素,目前已發(fā)現(xiàn)了160種TEM型衍生酶,呈酸性,等電點(diǎn)為5.2-6.5,其中大部分是ESBLs[8-11]。藥敏結(jié)果顯示本組PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物都有不同程度的耐藥,尤其對(duì)氨曲南和頭孢哌酮的耐藥率更分別高達(dá)45%和75%,攜帶TEM-1基因可能是本組PA對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的重要原因之一。而昆明地區(qū)PA的β-內(nèi)酰胺酶基因型除TEM-1型外,是否存在其它基因型別,其流行率如何,課題組正在進(jìn)行深入研究。

此外,藥敏試驗(yàn)顯示,該組PA不僅對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥,對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、碳青霉烯類、磺胺類和喹諾酮類等其他抗菌藥物也存在很高的耐藥率。PA表現(xiàn)為多重耐藥,其機(jī)制非常復(fù)雜,研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可通過(guò)基因變異或基因水平轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因,除產(chǎn)生各種β-內(nèi)酰胺酶,還可產(chǎn)生抗生素修飾酶、外排泵高表達(dá)、藥物作用靶位改變和外膜通透性改變等。PA對(duì)同一種類抗菌藥物的耐藥通常不是由單一因素造成的,而是幾種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果,其對(duì)不同種類抗菌藥物的耐藥機(jī)制也各有不同,還不斷有新的耐藥機(jī)制出現(xiàn),而且同一菌種在不同地區(qū)、不同時(shí)期其耐藥性和耐藥基因的攜帶狀況也不盡相同[12-15]。因此,檢測(cè)當(dāng)?shù)豍A的耐藥率及耐藥基因流行情況,對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)突變株,指導(dǎo)臨床合理使用抗生素,預(yù)防和控制感染具有重要意義。

[1]常 東,蔣 偉,魏 華,等.多重耐藥銅綠假單胞菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2006,16(9）:961.

[2]Bradford PA.Extended spectrumβ-lactamases in the 21st Century:characterization,epidemiology,and detection of this important resistance threat[J].ClinMicrobiol Rev,2001,14(4）:933.

[3]Coque TM,OliverA,Perez JC,et al.Genes encoding TEM-4,SHV-2,and CTX-M-10 extended-spectrum beta-lactamases are carried by multiple Klebsiella pneumonise clones in a single hospital[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46:500.

[4]Radice M,Power P,Conza JD,et al.Early dissemination of CTX-M-derived enzymes in south America[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(2）:602.

[5]Munday CJ,Xiong J,Li C,et al.Dissemination of CTX-M type beta-lactamases in Enterobacteriaceae isolates in the People's Republic of China[J].Int J Antimicrob Agents,2004,23(2）:175.

[6]王春新,糜祖煌,黃支密,等.中國(guó)部分地區(qū)銅綠假單胞菌β-內(nèi)酰胺酶基因型研究[J].中國(guó)抗生素雜志,2008,33(3）:164.

[7]陳賢君,李克誠(chéng),韓立中,等.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科細(xì)菌的基因型研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2007,22(3）:283.

[8]鐘運(yùn)華,何 林,周克元,等.超廣譜β-內(nèi)酞胺酶研究進(jìn)展[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008,29(3）:252.

[9]張 玲,黃留玉.革蘭陰性桿菌產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶研究進(jìn)展[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2008,18(6）:897.

[10]Patricia A,Bradford.Extended spectrum β-Lactamases in the 21st century:characterization,epidemiology,and detection of this important resistance threat[J].Clinical Microbiology Reviews,2001,14(4）:933.

[11]Varsha G.An update on newer β-lactamases[J].Indian J Med Res,2007,11:417.

[12]Zavasck AP,Carvalhaes CG,Picao RC,et al.Multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii:resistance mechanisms and implications for therapy[J].Expert Rev Anti Infect Ther,2010,8(1）:71.

[13]Poirell L,Weldhagen GF,Dechamps C,et al.A noso-comial outbreak of Pseudomonas aeruginosa isolates expressing the extended-spectrum betalactamase GES-2 in South Africa[J].J Antimicrob Chemother,2002,49(3）:561.

[14]Castanheira M,Toleman MA,Jones RP,et al.Molecular characterization of a β-lactamases gene,blagim-1,encoding a new subclass of metallo-βlactamases[J].Antimicrob Agents Chemother,2004,48(12）:4564.

[15]Normark BH,Normark S.Evolution and spread of antibiotic resistance[J].J Intern Med,2002,252(2）:91.